谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶抑制劑設(shè)計(jì)、合成及篩選.pdf

1、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferases，GST)主要存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，是由相同亞基構(gòu)成的二聚體；每個(gè)亞基有一個(gè)活性中心，包含谷胱甘肽結(jié)合位點(diǎn)(G-site)和相鄰疏水底物結(jié)合位點(diǎn)(H-site)。GST抑制劑可增強(qiáng)細(xì)胞毒性藥物抗腫瘤療效或直接抑制腫瘤生長(zhǎng)，因此，GST抑制劑的設(shè)計(jì)與篩選成為研究的重點(diǎn)。本文提取制備豬肝酸性GST同工酶，建立酶促動(dòng)力學(xué)測(cè)定GST抑制劑抑制能力方法，同時(shí)設(shè)計(jì)合成一系列GS

2、T抑制劑并進(jìn)行了篩選。
　　1、豬肝酸性GST同工酶制備及表征
　　從豬肝經(jīng)陰離子交換層析和親和層析制備GST酸性同工酶，此GST被純化146倍以上，活性總收率近30％。該GST對(duì)GSH和CDNB的Km分別為42μmol/L和0.86mmol/L，屬于隨機(jī)雙底物動(dòng)力學(xué)模型。
　　2、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶酶促動(dòng)力學(xué)測(cè)定其抑制劑抑制能力的方法
　　用還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)和1-氯-2，4-二

3、硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobenzene，CDNB)合成S-(2，4-二硝基苯基)-谷胱甘肽(GS-DNB)為候選抑制劑，以GSH與CDNB為底物測(cè)定GST在GS-DNB作用下的米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vm)，從而確定GS-DNB對(duì)GST的抑制常數(shù)(Ki)。GS-DNB對(duì)CDNB競(jìng)爭(zhēng)性Ki為(21±1)μmol/L(n=2)；對(duì)GSH競(jìng)爭(zhēng)性Ki為(17±1)μmol/L(n=2)。產(chǎn)物GS-DNB是GST的

4、高親和力競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑；測(cè)定GST動(dòng)力學(xué)參數(shù)隨抑制劑濃度的變化可篩選其抑制劑。
　　3、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶抑制劑的設(shè)計(jì)與篩選
　　通過(guò)對(duì)參考文獻(xiàn)以及脂水分配系數(shù)(LogP)等相關(guān)化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行考查，主要從兩條途徑對(duì)GST抑制劑進(jìn)行設(shè)計(jì)：一、參照GS-DNB的設(shè)計(jì)思路，針對(duì)G-位點(diǎn)和H-site雙位點(diǎn)設(shè)計(jì)產(chǎn)物型抑制劑Ⅰ，即以對(duì)氨基苯甲酸作為原料衍生的-疏水化合物與GSH的加合物；二、針對(duì)H-site可結(jié)合基團(tuán)設(shè)計(jì)較大體積疏水抑制

5、劑，用依他尼酸(ethacrvnicacid，EA)，4-丁基苯甲酸，3，5-二甲基苯甲酸，丹磺酰氯等羧酸作為功能基，1，3-丙二胺、1，5-戊二胺、賴(lài)氨酸和1，4-丁二胺作為連接臂，得到對(duì)稱(chēng)雙酰胺類(lèi)疏水型抑制劑Ⅱ。
　　通過(guò)酶促動(dòng)力學(xué)初速度法測(cè)定合成的GST抑制劑Ki進(jìn)行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1)大體積的Ⅱ類(lèi)抑制劑比Ⅰ類(lèi)抑制劑抑制能力強(qiáng)；2)Ⅱ類(lèi)抑制劑中N，N’-雙依他尼酰-1，4-丁二胺和N，N’-雙對(duì)丁基苯甲酰-1，4-丁二胺都為