家蠶嗅覺(jué)相關(guān)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶BmGSTD1的結(jié)構(gòu)與功能.pdf

1、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GlutathioneS-transferases，GSTs，EC2.5.1.18)是一種多功能的超家族酶，廣泛存在于哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物、真菌以及細(xì)菌等好氧生物體中。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在生物體內(nèi)是重要的第二相解毒酶，其主要功能是對(duì)異生質(zhì)或內(nèi)源的有毒物質(zhì)進(jìn)行代謝，從而達(dá)到解毒目的。除此外，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶還具有許多其它的功能。例如，具有過(guò)氧化酶功能，能在氧化應(yīng)激環(huán)境中保護(hù)有機(jī)體;還具有異構(gòu)酶功能;參與細(xì)胞生物

2、信號(hào)通路及生物合成方面。此外，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶能非催化性的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)大量?jī)?nèi)源或異生的成分。
　　 有一類嗅覺(jué)相關(guān)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在牛、大鼠、煙草天蛾、棉鈴蟲(chóng)和柑橘鳳蝶中報(bào)道。該類酶在嗅覺(jué)系統(tǒng)中推測(cè)的功能:一方面對(duì)有毒物質(zhì)進(jìn)行代謝解毒以保護(hù)嗅覺(jué)組織;另一方面參與嗅覺(jué)進(jìn)程。
　　 家蠶delta亞家族谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶有4個(gè)成員，其中BmGSTd1在NCBI登錄為從家蠶觸角克隆得到，其編碼氨基酸與煙草天蛾中鑒定的觸

3、角特異GST-msolfl在序列相似性上達(dá)到74.4％，并且在已有報(bào)道的進(jìn)化樹(shù)分析上，家蠶BmGSTd1、BmGSTd4與煙草天蛾的GST-msolfl聚為一簇?；谶@些線索，從家蠶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶鑒定嗅覺(jué)相關(guān)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，并進(jìn)行相關(guān)功能研究。
　　 本研究，從家蠶五齡第3天幼蟲(chóng)不同組織的基因芯片數(shù)據(jù)分析出發(fā)，結(jié)合RT-PCR從家蠶delta亞家族谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的4個(gè)成員中鑒定了家蠶嗅覺(jué)相關(guān)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶

4、候選基因BmGSTd1和BmGSTd4。同時(shí)，對(duì)家蠶BmGSTd1進(jìn)行了克隆和分析;利用原核表達(dá)、蛋白純化等技術(shù)獲得了家蠶BmGSTD1重組蛋白;利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段解析了BmGSTD1不結(jié)合底物和結(jié)合底物谷胱甘肽的晶體結(jié)構(gòu)，并對(duì)活性位點(diǎn)進(jìn)行分析;利用分光光度法和薄層層析法進(jìn)行了功能研究。
　　 本研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.家蠶嗅覺(jué)相關(guān)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的鑒定
　　 從NCBIGenBank下載家蠶BmGS

5、Td1、BmGSTd2和BmGSTd3的基因全長(zhǎng)序列，并在家蠶基因組上進(jìn)行BlastN比對(duì)獲取3個(gè)基因的基因芯片探針號(hào)?；诩倚Q五齡第3天不同組織芯片數(shù)據(jù)分析，家蠶BmGSTd1在頭部高量表達(dá)，在精巢少量表達(dá)。BmGSTd2基因在雌雄頭、脂肪體、中腸、血液和前中部絲腺中有表達(dá)。BmGSTd3基因在除絲腺外其它組織中具有表達(dá)。
　　 進(jìn)一步進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，在五齡第3天幼蟲(chóng)各組織中，家蠶BmGSTd1基因

6、在雌雄頭部、觸角和下顎須表達(dá)，而其它組織沒(méi)有表達(dá);BmGSTd2和BmGSTd3基因在雌雄各個(gè)組織表達(dá)均有表達(dá)。BmGSTd4基因在各個(gè)組織中都未檢測(cè)到表達(dá)。在成蟲(chóng)蛾各組織中，家蠶BmGSTd1基因在雄蛾觸角中高量表達(dá)，在足、尾鞘和生殖腺有微量表達(dá)，在雌蛾觸角中特異高量表達(dá);BmGSTd2基因在雄蛾中各個(gè)組織都有表達(dá)，在雌蛾中除脂肪體外各個(gè)組織中都有表達(dá);BmGSTd3基因表達(dá)情況和BmGSTd2基因相似;BmGSTd4基因只在雄蛾觸角

7、特異高量表達(dá)，在雌蛾各個(gè)組織中都沒(méi)有表達(dá)。
　　 2.家蠶嗅覺(jué)相關(guān)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的分析
　　 家蠶BmGSTd1與BmGSTd4基因都在第6號(hào)染色體同一scaffold上，兩者轉(zhuǎn)錄方向相同。BmGSTd1的ORF長(zhǎng)為657bp，編碼218個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為25.2kDa，等電點(diǎn)為5.16，不含有信號(hào)肽;BmGSTd4的ORF長(zhǎng)為738bp，編碼245個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為27.7kDa，等電點(diǎn)為

8、4.63，含有信號(hào)肽。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示BmGSTD1和BmGSTD4均具有完整的谷胱甘肽N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。
　　 BmGSTD1和BmGSTD4氨基酸序列相似性為61.2％，兩者與煙草天蛾GST-msolf1氨基酸序列相似性分別為74.4％和59.1％。BmGSTD1和BmGSTD4與已報(bào)道的嗅覺(jué)相關(guān)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示從第50位氨基酸殘基開(kāi)始，序列趨于保守，特別是第50位至第190位的氨基酸殘基，其中

9、部分殘基高度保守。BmGSTD與已解析結(jié)構(gòu)的昆蟲(chóng)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的delta和epsilon亞家族氨基酸序列比較保守，特別是活性位點(diǎn)的氨基酸殘基，包括催化關(guān)鍵殘基。氨基酸序列特征分析顯示BmGSTD1和BmGSTD4具有完整的二級(jí)結(jié)構(gòu)基序。
　　 3.家蠶BmGSTD1的原核表達(dá)和純化
　　 為了進(jìn)一步研究基因功能，根據(jù)BmGSTd1的ORF序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行克隆，將得到的ORF全長(zhǎng)片段亞克隆到原核表達(dá)載體p28，經(jīng)過(guò)

10、雙酶切鑒定和測(cè)序獲得了原核重組表達(dá)質(zhì)粒p28-BmGSTd1。重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在以加入終濃度為0.2mM的IPTG，37℃培養(yǎng)4h誘導(dǎo)表達(dá)條件下獲得了可溶性形式表達(dá)產(chǎn)物，并且特異條帶在25kDa位置處，與目的蛋白預(yù)測(cè)分子質(zhì)量大小相一致，獲得了重組表達(dá)的BmGSTD1可溶蛋白。通過(guò)Ni-NTA親和層析和凝膠過(guò)濾層析純化原核表達(dá)的重組BmGSTD1蛋白。以同樣的方法獲得了重組BmGSTD2和BmG

11、STD3蛋白。純化后的蛋白濃縮后，保存在-80℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 4.家蠶BmGSTD1的功能
　　 以1-氯-2，4-二硝基苯為底物，通過(guò)分光光度法測(cè)定重組家蠶BmGSTD1的酶活性參數(shù)為:結(jié)合常數(shù)Km=0.28mM，最大反應(yīng)速度Vmax=456.47μmol/mg/min。與已報(bào)道的家蠶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶對(duì)1-氯-2，4-二硝基苯酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較，重組家蠶BmGSTD1具有很好的結(jié)合常數(shù)和最大反應(yīng)速度，說(shuō)明其具

12、有較好的GST活性，暗示其可能參與有毒物質(zhì)的代謝解毒。以氣味分子反-2-己烯醛和反苯丙烯醛為底物，在100mMNaAc，pH4.5(10％DMF)緩沖液條件下，利用薄層層析法鑒定了BmGSTD1能催化GSH與這兩種氣味分子反應(yīng)。家蠶BmGSTd1基因在家蠶嗅覺(jué)器官中占優(yōu)勢(shì)表達(dá)，除了具有很好的GST活性，還能催化氣味分子與谷胱甘肽反應(yīng)，根據(jù)這些結(jié)果推測(cè)BmGSTD1在家蠶嗅覺(jué)系統(tǒng)的作用是:一方面是對(duì)有毒物質(zhì)進(jìn)行解毒以保護(hù)嗅覺(jué)器官;一方面是

13、作為清道夫?qū)M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的氣味分子進(jìn)行清理，維持嗅覺(jué)系統(tǒng)的敏感性和高效性。
　　 5.家蠶BmGSTD1的晶體結(jié)構(gòu)解析
　　 將純化獲得的重組BmGSTD1蛋白濃縮至4mg/mL，利用懸滴氣象擴(kuò)散法，1μL蛋白溶液(含10mMDTT)與1μL蛋白結(jié)晶下槽液(含100mMNaAc，pH4.6，8％pEG4000)在16℃靜置一天，獲得了BmGSTD1不結(jié)合底物的晶體。為了獲得BmGSTD1結(jié)合底物谷胱甘肽的晶體，在同樣條件下

14、加入5mM谷胱甘肽。獲得的晶體在上海光源用X-射線衍射后收集衍射數(shù)據(jù)，衍射數(shù)據(jù)用HKL2000處理。以大劣按蚊AdGSTD5的結(jié)構(gòu)(PDBID:1R5A)為模型利用分子置換獲得BmGSTD1不結(jié)合底物結(jié)構(gòu)正確的解，再利用REFMAC和WinCoot進(jìn)行結(jié)構(gòu)模型精修。BmGSTD1結(jié)合底物谷胱甘肽的以精修后的BmGSTD1不結(jié)合底物結(jié)構(gòu)為模型，進(jìn)行同樣處理。最后獲得了家蠶BmGSTD1不結(jié)合底物和結(jié)合底物谷胱甘肽的結(jié)構(gòu)。最終分辨率分別為2

15、.51A和2.12A。
　　 家蠶BmGSTD1結(jié)構(gòu)上活性形式是二聚體，衍射數(shù)據(jù)中顯示一個(gè)非對(duì)稱單元中存在4個(gè)分子，推測(cè)是蛋白質(zhì)結(jié)晶過(guò)程中晶體堆積造成。二聚體結(jié)構(gòu)中，兩個(gè)亞基通過(guò)α3、α4、α5、β4的一側(cè)和α2與β3之間的柔性區(qū)域上的氨基酸殘基的相互作用形成作用界面。二聚體的界面包埋面積接近2800A2。
　　 家蠶BmGSTD1整體結(jié)構(gòu)，屬于經(jīng)典的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)。每個(gè)亞基可分為兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域是

16、βαβαββα拓?fù)浠虻牧蜓踹€蛋白結(jié)構(gòu)，C端是由5個(gè)α螺旋以右手螺旋構(gòu)成的獨(dú)立結(jié)構(gòu)域，兩者之間由一短的柔性區(qū)域連接。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)中其它的相同特征在家蠶BmGSTD1結(jié)構(gòu)中也存在，如順式構(gòu)象的Pro58，引起α4螺旋中間斷裂的Gly107。
　　 組成家蠶BmGSTD1的谷胱甘肽結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基比較保守，大部分是親水性和極性的，它們通過(guò)氫鍵作用對(duì)谷胱甘肽進(jìn)行結(jié)合和穩(wěn)定。其中的Ser14與谷胱甘肽的巰基形成3.65A