家蠶雄蛾觸角特異谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶BmGSTD4的基因克隆、表達(dá)及功能研究.pdf

1、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferases,GSTs,EC2.5.1.18)是多功能的超家族酶類,廣泛存在于動(dòng)物、植物、昆蟲、細(xì)菌及真菌中。其主要功能是對(duì)內(nèi)源或異源性有毒物質(zhì)進(jìn)行代謝解毒。除此之外,其還具有抗氧化應(yīng)激作用,異構(gòu)酶作用,并參與哺乳動(dòng)物信號(hào)通路調(diào)控。有些GSTs還有非催化作用地結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)不同配體功能。有一類嗅覺相關(guān)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在牛、大鼠、煙草天蛾、棉鈴蟲以及柑橘鳳蝶中被鑒定,并猜測(cè)在

2、嗅覺中發(fā)揮作用。
　　 家蠶Delta亞家族谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶BmGSTd4與煙草天蛾觸角特異基因GST-msolf1序列同源性高達(dá)70%以上,而在進(jìn)化樹上聚為一簇。并且BmGSTd4沒有全長(zhǎng)CDS序列,報(bào)道較少。基于以上線索,猜測(cè)BmGSTd4的功能是否與嗅覺相關(guān)?
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.BmGSTd4基因的表達(dá)特征分析
　　 利用RT-PCR對(duì)BmGSTd4基因在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織

3、中的表達(dá)特征進(jìn)行分析。結(jié)果表明BmGSTd4在家蠶從蟻蠶至化蛾第1天的不同發(fā)育時(shí)期中,只在雄蛾第1天具有微量表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證時(shí)期表達(dá)譜顯示的結(jié)果,在五齡第3天各組織中沒有表達(dá),取蛾期不同組織進(jìn)行表達(dá)模式分析,發(fā)現(xiàn)BmGSTd4在雌蛾各組織中無表達(dá),只在雄蛾第1天的觸角中特異并高量表達(dá),這一結(jié)果與時(shí)期表達(dá)譜結(jié)果一致。
　　 2.BmGSTd4基因的全長(zhǎng)克隆及序列分析
　　 家蠶delta亞家族谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶有4個(gè)

4、成員,從NCBIGenBank下載家蠶BmGSTd4不完整序列,對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。
　　 以家蠶的大造品種雄蛾觸角中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,利用RACE技術(shù)分別得到225bp大小的5'端片段和221bp大小的3'端片段,將兩段序列與余預(yù)測(cè)的基因序列進(jìn)行比對(duì),去除重疊序列,拼接后得到1049bp(含polyA)大小的全長(zhǎng)cDNA序列。通過ORF檢索,該序列由738bp的編碼區(qū),90bp的5'UTR和221

5、bp的3'UTR組成,共編碼246個(gè)氨基酸,蛋白大小27kDa,等電點(diǎn)pI為4.66。染色體定位結(jié)果顯示該基因位于家蠶6號(hào)染色體上的nscaf2853上,由一個(gè)內(nèi)含子和一個(gè)外顯子組成。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示該基因編碼的蛋白質(zhì)具有完整的結(jié)構(gòu)域,即GST的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。信號(hào)肽預(yù)測(cè)前22個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。
　　 利用Clastalx將BmGSTD4與從NCBI上下載的已報(bào)道其他物種的谷胱甘肽轉(zhuǎn)-S-移酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),再用MEG

6、A5軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示,家蠶Delta家族兩兩聚為一簇,BmGSTD2、BmGSTD3聚類在一起,與柑橘風(fēng)蝶嗅覺基因進(jìn)化關(guān)系相近,BmGSTD1和BmGSTD4聚類在一起,與煙草天蛾、棉鈴蟲嗅覺特異基因進(jìn)化關(guān)系一致。
　　 3.BmGSTD4的原核表達(dá)與抗體制備
　　 由于BmGSTd4編碼蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)含有信號(hào)肽,并且為了改善原核表達(dá)情況,對(duì)BmGSTD4截短了N端前24個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行表達(dá)。成功構(gòu)建帶有N端His標(biāo)

7、簽的BmGSTd4-p28融合蛋白表達(dá)載體,并在Rosetta(DE3)表達(dá)菌株中成功誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 通過Ni-NTA親和層析純化原核表達(dá)的重組BmGSTD4蛋白,得到的蛋白進(jìn)行除鹽和濃縮,得到約500μL濃度為13μg/μL的重組蛋白。取200μLBmGSTD4蛋白制備商業(yè)化多克隆抗體,抗體效價(jià)是1:100000。
　　 4.BmGSTD4的定位和功能初探
　　 利用純化得到的BmGSTD4和制備的多克隆抗體

8、,進(jìn)一步利用westernblot在蛋白水平上驗(yàn)證BmGSTD4的特異性。結(jié)果顯示BmGSTD4在雄蛾觸角中特異表達(dá),與RT-PCR結(jié)果相一致。
　　 在雄蛾觸角中進(jìn)行BmGSTD4的免疫熒光定位,與對(duì)照相比:在嗅覺感器中發(fā)現(xiàn)明顯的熒光信號(hào),可以證明BmGSTD4存在于嗅覺毛形感受器中。
　　 以1-氯-2,4-硝基苯(CDNB)作為反應(yīng)底物,測(cè)量BmGSTD4在340nm處的吸光值變化。在通過軟件分析得到標(biāo)準(zhǔn)酶活曲線,

9、并計(jì)算出Km值是0.020±0.001(mM),Vm值是176.302±4.943(μmol/min/mg),說明BmGSTD4具有較好的活性。
　　 RT-PCR和westernblot結(jié)果證明BmGSTD4的雄蛾觸角特異性,免疫熒光定位結(jié)果說明其存在于嗅覺毛形感受器中。酶學(xué)測(cè)定結(jié)果顯示重組表達(dá)的BmGSTD4具有較好的GST解毒活性。這些結(jié)果暗示BmGSTD4在感器腔內(nèi)的淋巴液中發(fā)揮解毒功能,對(duì)觸角進(jìn)行保護(hù)。BmGSTD4的