中華蜜蜂谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和小分子熱激蛋白基因的生物學(xué)功能分析.pdf

1、自然生態(tài)環(huán)境的變化使得蜜蜂種群面臨日益嚴(yán)峻的生存和延續(xù)考驗(yàn)。提高蜜蜂自身防御能力是保持蜂群健康發(fā)展的重要前提。中華蜜蜂(Apis cerana cerana)是我國(guó)特有的蜜蜂種質(zhì)資源，對(duì)于維護(hù)與其有關(guān)的植物共生生態(tài)系統(tǒng)的平衡，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。本研究基于已經(jīng)證實(shí)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases，GSTs)參與調(diào)控生物體的抗氧化功能和小分子熱激蛋白(small heat shock p

2、roteins，sHSPs)在細(xì)胞損傷防御及生物保護(hù)中執(zhí)行的特殊作用，以中華蜜蜂為實(shí)驗(yàn)材料，開(kāi)展了GSTO2和sHsp22.6基因的功能研究，從分子水平上探討了中華蜜蜂自身防御能力與其GSTO2和sHsp22.6基因的聯(lián)系。具體研究結(jié)果與主要結(jié)論如下:
　　(1)中華蜜蜂GSTO2基因的分子特性和功能分析
　　根據(jù)西方蜜蜂(Apis mellifera Linnaeus)的同源序列，利用RT-PCR和RACE-PCR的方法，

3、從中華蜜蜂中克隆到一個(gè)新的Omega族GST基因，命名為AccGSTO2。序列分析表明:該基因cDNA全長(zhǎng)為1365bp，包括321bp的5'非翻譯區(qū)、324bp的3'非翻譯區(qū)和720bp的開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)包含239個(gè)氨基酸殘基的多肽，預(yù)測(cè)分子量和等電點(diǎn)分別為27.785kDa和6.21。中華蜜蜂AccGSTO2的氨基酸序列與其他昆蟲(chóng)GSTOs有較高的同源性，并具有細(xì)胞質(zhì)GST超家族保守的功能區(qū)域。
　　用TFSEARCH在線(xiàn)

4、軟件程序?qū)Ψ蛛x的AccGSTO2基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了分析，不僅預(yù)測(cè)到CF2-Ⅱ、BR-C、NIT2等若干與早期組織發(fā)育和生長(zhǎng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，兩個(gè)與調(diào)節(jié)環(huán)境應(yīng)激有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(HSF和AP-1)以及基因表達(dá)調(diào)控元件（CREB和C/EBP）的結(jié)合位點(diǎn)也被發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表明，AccGSTO2基因可能參與蜜蜂的發(fā)育和環(huán)境應(yīng)激響應(yīng)。
　　采用qRT-PCR和Western blot的方法研究了中華蜜蜂不同發(fā)育時(shí)期和組織中的AccGS

5、TO2基因的表達(dá)特性。結(jié)果表明，在3日齡幼蟲(chóng)時(shí)期和腦組織中AccGSTO2表達(dá)量最高，表明AccGSTO2可能與幼蟲(chóng)早期發(fā)育及維持蜜蜂腦組織的正常功能相關(guān)。
　　應(yīng)用qRT-PCR的方法探究了AccGSTO2基因在不同生物及非生物應(yīng)激中的表達(dá)特性。結(jié)果表明，AccGSTO2基因的轉(zhuǎn)錄水平受到蜂球囊菌、黃曲霉菌、20羥基蛻皮激素(20E)等生物因素及溫度、紫外線(xiàn)、H2O2、農(nóng)藥、CdCl2等非生物因素的應(yīng)激而誘導(dǎo)提高，但HgCl2處

6、理后則出現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄的抑制現(xiàn)象。Western blot結(jié)果在蛋白水平上進(jìn)一步證實(shí)了CdCl2和黃曲霉菌等處理對(duì)基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用，蜜蜂體內(nèi)氧化狀態(tài)的測(cè)定表明這種誘導(dǎo)是氧化應(yīng)激的結(jié)果。綜上結(jié)果表明，AccGSTO2基因可能在中華蜜蜂的氧化應(yīng)激和組織發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
　　利用RNA干擾(RNA interference，RNAi)的方法進(jìn)一步研究了AccGSTO2基因的生物學(xué)功能。將合成的dsAccGSTO2注射到新出房的成年蜜蜂

7、胸部或飼喂3日齡幼蟲(chóng)，qRT-PCR結(jié)果顯示，成年蜜蜂注射后第3天和幼蟲(chóng)飼喂1天后，AccGSTO2的表達(dá)量降低最為顯著。免疫組織化學(xué)的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)成年蜜蜂的頭部、肌肉和中腸，幼蟲(chóng)的中腸、馬氏管和脂肪體細(xì)胞的表達(dá)量相比對(duì)照組明顯減少。上述處理組蜜蜂的抗氧化基因，除Accp45O的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)外，AccGSTD，AccGSTs4，AccSOD，AccCAT的轉(zhuǎn)錄水平都出現(xiàn)不同程度的降低。與對(duì)照組蜜蜂相比，dsAccGSTO2處理組蜜蜂的H2O2

8、，丙二醛(MDA)含量明顯升高，存活率顯著降低。以上結(jié)果一方面表明了dsAccGSTO2處理成功抑制了蜜蜂AccGSTO2基因的表達(dá)，同時(shí)也表明AccGSTO2基因的敲除破壞了蜜蜂抗氧化體系的平衡，降低了蜜蜂的生存率。
　　采用原核表達(dá)載體pET-30a(+)并優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件成功獲得了可溶性的AccGSTO2重組蛋白，進(jìn)一步通過(guò)親和層析的方法進(jìn)行分離純化，純化的重組蛋白的濃度達(dá)到1.89mg/mL。酶學(xué)特性的分析表明，重組Acc

9、GSTO2不僅具有對(duì)通用底物CDNB的谷胱甘肽(GSH)結(jié)合活性和以異丙苯-過(guò)氧化氫、叔丁基過(guò)氧化氫為底物的GSH過(guò)氧化物酶活性，還有較高的脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)活性。重組AccGSTO2的最適溫度是25℃、最適pH為7.0。
　　利用混合功能氧化(mixed-function oxidation，MFO)系統(tǒng)和紙盤(pán)擴(kuò)散分析的方法研究了重組AccGSTO2蛋白的抗氧化功能。在MFO實(shí)驗(yàn)中，重組AccGSTO2蛋白以濃度依賴(lài)

10、的方式保護(hù)質(zhì)粒DNA免遭系統(tǒng)中產(chǎn)生的羥自由基的剪切，并且發(fā)現(xiàn)這種保護(hù)作用與分子中半胱氨酸的巰基有關(guān)。紙盤(pán)擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果為重組AccGSTO2蛋白在氧化條件下的保護(hù)作用提供了進(jìn)一步的證據(jù)。
　　通過(guò)定點(diǎn)突變的方法獲得了3個(gè)AccGSTO2的突變體:C28A、C124A和C217A。酶動(dòng)力學(xué)和內(nèi)外熒光光譜學(xué)研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體C28A和C124A有明顯的酶活性喪失和最大發(fā)射波長(zhǎng)的偏移。MFO系統(tǒng)和紙盤(pán)擴(kuò)散分析的結(jié)果為這兩個(gè)位點(diǎn)半胱氨

11、酸在AccGSTO2抗氧化功能方面的關(guān)鍵作用提供了一個(gè)直接證據(jù)。3個(gè)突變體的三維同源結(jié)構(gòu)模型也提供了一個(gè)直觀的證據(jù)，突變體的表面電荷分布、疏水性斑塊及空間結(jié)構(gòu)的改變可能是引起其部分功能喪失的重要因素。突變體C217A則與野生型AccGSTO2的功能特性基本相似。以上結(jié)果表明Cys28和Cys124在維持AccGSTO2的結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮重要作用。
　　(2)中華蜜蜂sHsp22.6基因的分子特性和功能分析
　　利用上述的方

12、法，從中華蜜蜂中克隆到一個(gè)新的小分子熱激蛋白基因，命名為AccsHsp22.6。該基因cDNA全長(zhǎng)904bp，其中5'非翻譯區(qū)115bp、3'非翻譯區(qū)204bp和開(kāi)放閱讀框720bp，編碼一個(gè)包含194個(gè)氨基酸殘基的多肽，預(yù)測(cè)分子量22.605kDa，等電點(diǎn)5.88。中華蜜蜂sHSP22.6的氨基酸序列與其他昆蟲(chóng)sHSPs有較高的同源性，并具有sHSP超家族典型的結(jié)構(gòu)特征。
　　通過(guò)MatInspector在線(xiàn)軟件程序，在分離的A

13、ccsHsp22.6基因啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè)到參與早期組織發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(CF2-Ⅱ、BR-C、CdxA和NIT2)。幾個(gè)與環(huán)境應(yīng)激及免疫響應(yīng)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(HSF、AP-1、Nrf2、NFκB和p53等)也被發(fā)現(xiàn)。以上結(jié)果表明，AccsHsp22.6基因可能參與蜜蜂的早期發(fā)育和應(yīng)激保護(hù)機(jī)制。
　　利用qRT-PCR和Western blot的方法研究了AccsHsp22.6基因在不同發(fā)育時(shí)期和組織中的表達(dá)特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

14、，該基因總是在蜜蜂不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)型期高水平表達(dá)，尤其在新出房的成蟲(chóng)和中腸組織中表達(dá)量最高，表明AccsHsp22.6可能參與蜜蜂發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)換及維持中腸組織的正常功能。
　　應(yīng)用qRT-PCR的方法研究了AccsHsp22.6基因在不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)特性。結(jié)果表明，AccsHsp22.6基因的轉(zhuǎn)錄水平在大多數(shù)處理中誘導(dǎo)上調(diào)，包括熱、冷、紫外線(xiàn)、H2O2、三氟氯氰菊酯、CdCl2等非生物因素和蜂球囊菌、黃曲霉菌、20羥基蛻皮激素

15、(20E)等生物因素。但是該基因在25℃、辛硫磷、百草枯、HgCl2處理后其轉(zhuǎn)錄沒(méi)有明顯的誘導(dǎo)，有時(shí)甚至出現(xiàn)抑制的現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，AccsHsp22.6基因可能在中華蜜蜂應(yīng)對(duì)大多數(shù)不利因素的應(yīng)激保護(hù)中發(fā)揮重要作用。
　　利用RNAi的方法進(jìn)一步研究了AccsHsp22.6基因的生物學(xué)功能。將合成的dsAccsHsp22.6注射到新出房的成年蜜蜂胸部，qRT-PCR結(jié)果顯示，成年蜜蜂注射后第1-3天，AccsHsp22.6的表達(dá)

16、量降低較為顯著。免疫組織化學(xué)的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，成年蜜蜂的中腸、馬氏管、肌肉和脂肪體細(xì)胞的表達(dá)量均比對(duì)照組明顯減少。在4℃和50℃條件下，dsAccsHsp22.6注射3天后的蜜蜂其存活率與對(duì)照組蜜蜂相比顯著降低。以上結(jié)果不僅說(shuō)明AccsHsp22.6基因的表達(dá)被有效抑制，而且表明該基因的敲除降低了蜜蜂對(duì)極端溫度的耐受能力。
　　采用原核表達(dá)載體pET-30a(+)，優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，通過(guò)親和層析的方法成功表達(dá)并純化了可溶性的AccsH