甜菜夜娥cDNS文庫構(gòu)建及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因分子特性研究.pdf

1、甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)，是鱗翅目夜蛾科一種農(nóng)業(yè)害蟲，也是目前殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性最嚴(yán)重的害蟲。本研究以甜菜夜蛾為對象，構(gòu)建了甜菜夜蛾cDNA文庫，從文庫中篩選并克隆甜菜夜蛾谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因SeGSTe和SeGSTo，研究了基因的分子特性，主要研究結(jié)果如下:
　　1、甜菜夜蛾cDNA文庫的構(gòu)建
　　為克隆與甜菜夜蛾抗藥性相關(guān)基因，本試驗以不同發(fā)育時期甜菜夜蛾幼蟲和成蟲為對象構(gòu)建了甜菜夜蛾c

2、DNA文庫，并利用生物信息學(xué)方法及EST技術(shù)分析了編碼甜菜夜蛾相關(guān)蛋白和酶的基因的分子特性，隨機挑取單克隆測序，通過NCBI比對獲得782條獨立基因的EST，基因序列分析結(jié)果表明，782個獨立EST中，有157個(20.1％)為編碼未知蛋白的基因，279個(35.7％)與已知編碼蛋白質(zhì)基因具有較高的同源性，其余為已經(jīng)功能注釋的蛋白編碼基因，主要為:催化酶類;代謝、細(xì)胞運輸、能量循環(huán)、轉(zhuǎn)錄翻譯和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等蛋白。
　　2、甜菜夜蛾GS

3、Te和GSTo基因分子特性研究
　　從構(gòu)建的甜菜夜蛾的cDNA文庫中挑選并克隆了兩個谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因，分別為SeGSTe和SeGSTo。SeGSTe的cDNA序列，編碼區(qū)全長為672 bp，編碼224個氨基酸;SeGSTo基因5'端非編碼區(qū)80 bp，3'端非編碼區(qū)長184 bp，編碼區(qū)全長747 bp，編碼249個氨基酸。氨基酸序列同源性分析結(jié)果顯示，甜菜夜蛾GSTe與已知的GSTe具有非常高的相似度，與斜紋夜蛾的GSTe

4、相似度最高，達98％;甜菜夜蛾GSTo與已知的GSTo也具有較高的相似度，與家蠶的GSTo相似度最高，達79％;系統(tǒng)發(fā)育分析表明SeGSTe屬于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶epsilon家族，SeGSTo屬于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶omega家族;利用熒光定量PCR技術(shù)分析了不同組織和不同發(fā)育時期SeGSTe和SeGSTo基因mRNA表達水平。結(jié)果顯示:在甜菜夜蛾中腸組織中，SeGSTe和SeGSTo基因在其4齡和5齡時均有較高表達，而預(yù)蛹期后表達量較

5、低;SeGSTe和SeGSTo基因在脂肪體中較其在中腸中表達量低，其中在4齡第1天表達量最高，到第2、3天表達量逐漸降低，5齡1、2天中表達量也較高，從5齡第3天開始下降，在預(yù)蛹期表達量較高，蛹期從第1天到第6天逐漸升高，且第6天表達量最高，成蟲期表達量下降。采用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得了可溶性重組蛋白SeGSTe和SeGSTo，經(jīng)SDS-PAGE分析，SeGSTe的分子量約為25 ku; SeGSTo的分子量約為29 ku。重組蛋白S