建立篩選尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶抑制劑的方法.pdf

1、第一部分建立尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶抑制劑的篩選方法
　　目的:建立篩選尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)抑制劑的方法。
　　方法:以1，4-二馬來酰亞胺基丁烷（1，4-Bismaleimidobutane，BMB）交聯(lián)G355C/D393C雙突變NAMPT，封堵其催化活性中心，以NAMPT野生型及交聯(lián)型NAMPT蛋白的自發(fā)熒光變化（280nm激發(fā)，333nm發(fā)射），來檢測(cè)化合物與蛋白的結(jié)合，以核磁共振方法體外檢測(cè)化合物對(duì)N

2、AMPT催化作用的影響，以MTT方法檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞活性的影響。
　　結(jié)果:FK8660.1-1.0μM能夠濃度依賴的抑制野生型NAMPT自發(fā)熒光，但對(duì)BMB-NAMPT的自發(fā)熒光沒有影響。迷迭香酸、洋薊素、1，3二咖啡奎寧酸0.5-50μM能夠濃度依賴的抑制野生型NAMPT和BMB-NAMPT的自發(fā)熒光，對(duì)兩種蛋白自發(fā)熒光的抑制率無顯著差異。FK866分子比1∶1（化合物:NAMPT蛋白）能夠顯著抑制NAMPT的催化作用，但迷迭

3、香酸、洋薊素、1，3二咖啡奎寧酸分子比100∶1（化合物:NAMPT蛋白）對(duì)NAMPT的催化作用無抑制作用。10-7M FK866時(shí)間依賴的抑制A549細(xì)胞的活性，10-8～10-5 M迷迭香酸、洋薊素、1，3二咖啡奎寧酸對(duì)A549的細(xì)胞活性無抑制作用，反而在高濃度下對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞活性有一定的增強(qiáng)作用。
　　結(jié)論:基于NAMPT和BMB-NAMPT蛋白的內(nèi)源性熒光檢測(cè)法可以篩選與NAMPT蛋白結(jié)合的化合物，并分析化合物是否結(jié)

4、合在NAMPT的催化活性部位，迷迭香酸、洋薊素、1，3二咖啡奎寧酸可結(jié)合在NAMPT催化活性位點(diǎn)以外的部位。
　　第二部分建立篩選尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶非酶作用阻斷劑的細(xì)胞模型
　　目的:建立一種篩選尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)非酶作用阻斷劑的細(xì)胞模型。
　　方法:通過突變，獲得酶活作用完全消失的NAMPT蛋白，以熒光光譜法檢測(cè)無ATP時(shí)NAMPT的催化作用;以Real time-PCR方法檢測(cè)IL-6 mRN

5、A的表達(dá)，觀察各種NAMPT蛋白誘導(dǎo)BV2細(xì)胞和THP-1細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的作用;獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIL-6-promoter-luc質(zhì)粒的BV2細(xì)胞株，用于IL-6 mRNA表達(dá)的高通量篩選。
　　結(jié)果:H247A、 R311D、R392E、K423E突變均能夠顯著減弱NAMPT蛋白的催化作用，其中R392E突變使NAMPT的催化作用完全消失。NAMPT蛋白能夠誘導(dǎo)BV2細(xì)胞和THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-6 mRNA，其作用與