USP2抑制劑篩選體系的建立及應用.pdf

1、泛素化及去泛素化是機體生命進程中必不可少的翻譯后修飾過程,蛋白經泛素化修飾后被降解,去泛素化酶則能逆轉泛素化過程使蛋白免受降解。在去泛素化蛋白的五類家族中,泛素特異性激酶2引起了人們的關注。USP2有三個異構體,USP2a、USP2b以及USP2c,他們的C端結構相同而N端結構不同,它們都能使底物去泛素化,而N端結構的不同造就了它們的底物特異性。其中USP2a作為一種抑癌基因在多種癌癥細胞中高表達,其保護癌細胞不凋亡。USP2a具有多種

2、底物,USP2a的高表達不僅能造成FASN的累積使FASN水平紊亂,從而抑制細胞色素C的釋放及Caspase的失活;USP2a高表達還造成MDM2水平的紊亂,使得抑癌基因p53泛素化增多,最終導致p53誘導的腫瘤細胞的凋亡減少。Cyclin D1也是USP2a的重要底物之一,Cyclin D1是細胞由G1期過渡到S期的重要調控因子,癌細胞中可明顯觀察到Cyclin D1表達水平升高。USP2a與癌癥之間的關系提示:USP2a可能是一個重

3、要的癌癥治療藥物靶點,因此本課題組決定以USP2a為研究對象,建立USP2a抑制劑體外篩選體系,并對一系列化合物進行活性篩選。在USP2a抑制劑體外篩選體系的建立過程中,首先構建了Human-USP2a/USP2催化區(qū)質粒及Human-UBA52質粒并在大腸桿菌(BL21)中進行表達,后通過鎳柱純化法得到USP2催化區(qū)蛋白及底物GST-UBA52,此外,通過SDS-PAGE檢測、Western Blot檢測、考馬斯亮藍染色、灰度掃描及定

4、量等方法確定了底物和酶的最佳用量及最佳反應時間等。最終,建立了USP2a抑制劑體外篩選體系。利用建立的篩選平臺,發(fā)現(xiàn)天然藥物紫菀酮(Shionone,SH)在體外對USP2a具有抑制作用,并通過Ub-CHOP-Reporter Kit測試驗證了這一結果;同時體內實驗結果顯示:SH能夠引起NB4細胞(USP2高表達)中USP2底物蛋白Cyclin D1的表達水平下調;流式細胞術檢測結果顯示:SH處理NB4細胞48h時S,G2/M期細胞減少