應用質(zhì)譜技術篩選激酶抑制劑.pdf

1、蛋白激酶是一類磷酸轉(zhuǎn)移酶，可將ATP的γ磷酸基轉(zhuǎn)移到底物特定的氨基酸殘基上，使蛋白質(zhì)磷酸化。蛋白激酶在調(diào)節(jié)細胞的多種生命活動和疾病的進程中發(fā)揮著關鍵作用。異常的磷酸化與許多疾病相關，如癌癥、炎癥或免疫系統(tǒng)紊亂等。以蛋白激酶作為藥物靶點，尋找與之相互作用的小分子化合物，并進一步優(yōu)化用于新藥研發(fā)是當今蛋白激酶研究領域的一個重要方向。傳統(tǒng)的激酶抑制劑篩選方法雖然可以采用高通量的方式進行，但仍然存在以下缺點：偶聯(lián)反應易導致非特異性結果、放射性同

2、位素或熒光標記底物價格昂貴并可能產(chǎn)生同位素污染、篩選操作過程復雜易出現(xiàn)假陰性或假陽性結果等。因此，結合高通量的特點，尋求補充的激酶抑制劑的篩選方法非常有意義。 隨著質(zhì)譜技術的不斷改進和完善，質(zhì)譜的應用范圍已擴展到生命科學研究的許多領域。質(zhì)譜用于酶活性的測定及酶動力學研究也越來越廣泛。本文應用質(zhì)譜技術建立了激酶抑制劑的篩選方法，具體如下： (一)以新功能蛋白激酶RX218為研究對象，建立了激酶抑制劑高通量篩選方法。采用經(jīng)典

3、的Fmoc固相合成策略，以及平行合成及“混—分”編碼合成等組合化學技術合成了含有86條多肽的肽庫，并結合Kinase—Glo()發(fā)光檢測法篩選到了RX218激酶底物(Pep8)。以Pep8為底物，經(jīng)過優(yōu)化激酶反應體系中的ATP濃度、激酶用量、底物Pep8濃度等首次建立了激酶RX218的Kinase—Glo()發(fā)光檢測篩選模型。應用該模型對本課題組的640個單一純化合物進行篩選后，發(fā)現(xiàn)8個活性化合物。其中活性較高的2個化合物的IC50值分

4、別為38.7μM(P3—A7)和43.2μM(V8807)。 (二)以Pep8為激酶RX218的多肽底物，采用HPLC—MS聯(lián)用技術中的質(zhì)譜閥切換功能進行樣品脫鹽前處理，通過優(yōu)化液相梯度、質(zhì)譜檢測條件以及激酶反應體系等，建立了激酶抑制劑的色譜—質(zhì)譜聯(lián)機篩選方法。研究中對LC—MS篩選體系進行了系統(tǒng)的方法學考察，并對篩選模型的穩(wěn)定性進行了評價。結果表明，該方法線性、重復性良好。Z'因子評價表明該方法可用于高通量篩選。 (三

5、)應用已建立的模型對20個聯(lián)苯類化合物進行了初步構效關系研究，并發(fā)現(xiàn)化合物V8804活性高于V8807。利用UHP氧化法合成了內(nèi)標物Pep8(O2)-P，在存在內(nèi)標及無內(nèi)標的條件下，應用質(zhì)譜法測定其IC50值分別為19.1μM及14.4 μM。同時應用Kinase—Glo()發(fā)光檢測法測得其IC50值為15.4μM，證明兩種方法檢測結果一致。 (四)應用已建立的模型，篩選了本課題組現(xiàn)有的1，2，7.三取代—1H—咪唑并[

6、4，5—g]喹喔啉—6—酮類混合物化學庫(1850個化合物)。發(fā)現(xiàn)了4個對RX218有抑制作用的化合物，其IC50值分別為38.3μM(F3—E)，98μM(E5—A)，110μM(D6—D)，72μM(D6—E)。全文總共發(fā)現(xiàn)了13個活性化合物，其中活性較高的4個化合物為P3—A7，V8807，V8804，F(xiàn)3—E。 綜上所述，本論文創(chuàng)新點如下： 1.建立了LC—MS激酶抑制劑篩選新方法。該法特點是：均質(zhì)顯著減少了假性

7、結果、不需要標記底物節(jié)約了篩選成本、無同位素標記免除了放射性對實驗者以及放射性同位素垃圾對環(huán)境的危害、不需要偶聯(lián)反應可以直接對抑制作用進行定量。 2.將組合化學混合物合成化學與LC—MS高通量篩選相結合進行混合物化學庫篩選，顯著提高了篩選效率。 3.應用HPLC—MS聯(lián)用技術及質(zhì)譜的閥切換功能進行樣品的脫鹽處理。 4.LC—MS激酶抑制劑篩選新方法與傳統(tǒng)Kinase—Glo()發(fā)光檢測法結果一致。 5.篩