人谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶抑制劑的篩選及Rhein改善胰島素抵抗和脂代謝紊亂作用的實驗研究.pdf

1、己糖胺通路(Hexosamine biosymthesis pathway,HBP)是葡萄糖代謝的途徑之一,其關(guān)鍵酶是谷氨酰胺:6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶(Glutamine:fructose-6-phosphateamidotransferase,GFAT),終產(chǎn)物是二磷酸尿嘧啶-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)。近年來研究發(fā)現(xiàn)該通路作為機體的能量感受器,在胰島素抵抗、脂代謝紊亂、糖尿病及其血管并發(fā)癥等的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作

2、用。己糖胺通路的流量增加及O-GlcNAc的水平升高,與胰島素抵抗及其相關(guān)代謝性疾病的代謝紊亂密切相關(guān)。對己糖胺通路的研究,將為探討代謝綜合征的發(fā)病機制及治療途徑提供新的線索。本論文分三個部分展開。
　　 一、人谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶(hGFAT)抑制劑的篩選
　　 從人肝組織的cDNA中擴增出hGFAT1基因全長片段,構(gòu)建了大腸桿菌表達質(zhì)粒pET32b-GFAT,在大腸桿菌Origami(DE3)中表達了hG

3、FAT蛋白。通過鎳離子螯合柱(Ni-NTA)親和層析柱,獲得了純度較高的hGFAT蛋白。使用GDH法檢測了重組hGFAT蛋白的催化活性,并初步探討了GFAT的酶動力學特性。利用重組hGFAT蛋白,建立了GFAT抑制劑體外篩選方法。并篩選天然產(chǎn)物和化學合成樣品300多樣次,發(fā)現(xiàn)大黃酸(Rhein)對GFAT的抑制作用。
　　 通過生物信息學分析hGFAT的抗原性和屬間同源性,選擇人和小鼠相同的基因區(qū)域；擴增小鼠肝臟cDNA中GFA

4、T基因片段,構(gòu)建了大腸桿菌表達質(zhì)粒pET28b-GFAT。在大腸桿菌BL21(DE3)中表達了Ab-hGFAT蛋白,用Ni-NTA純化了重組Ab-hGFAT,免疫BALB/c小鼠,得到特異性較高的抗hGFAT多克隆抗體。并觀察了T型糖尿病小鼠模型和胰島素抵抗小鼠模型各組織GFAT的表達情況。Rhein可降低胰島素抵抗小鼠骨骼肌組織中GFAT的表達。
　　 成功將hGFAT基因轉(zhuǎn)入胰島素受體多表達的HIRc細胞,建立了hGFAT高

5、表達的hGFAT-HIRc細胞模型。與HIRc細胞比較,hGFAT-HIRc細胞GFAT的蛋白水平、mRNA水平及活性均有所升高;其形態(tài)無明顯變化,細胞周期改變不明顯；MTT實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)入基因的細胞對GFAT抑制劑的敏感性略有增加。胰島素誘導的細胞葡萄糖攝取能力明顯降低；胰島素刺激下的細胞內(nèi)O-糖基化水平升高；胰島素刺激下Akt的磷酸化水平降低,Akt的O-糖基化水平升高。Rhein對hGFAT-HIRc的細胞周期無明顯影響,但可降

6、低GFAT的活性,抑制細胞總體的O-糖基化水平。Rhein還可改善hGFAT-HIRc細胞的胰島素誘導的葡萄糖攝取能力,升高Akt的Ser473位磷酸化水平,并降低Akt的O-糖基化水平。
　　 二、Rhein改善胰島素抵抗的藥理作用及機制研究
　　 Rhein具有明顯的GFAT抑制作用,降低高脂飼料誘導的胰島素抵抗小鼠(HFD)升高的GFAT活性及蛋白表達,降低其肌肉中O-糖基化水平。
　　 GFAT抑制劑Rh

7、ein可呈劑量依賴性地提高機體的胰島素敏感性,降低HFD小鼠血清中胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù),改善葡萄糖耐受能力和胰島素耐受能力,增加正糖鉗實驗中機體整體的胰島素依賴的葡萄糖代謝能力和肝臟、骨骼肌、脂肪等胰島素靶組織的胰島素依賴的葡萄糖攝取能力。Rhein對HFD小鼠的胰島素增敏作用,可能與增強胰島素信號通路中胰島素誘導的IR-β和IRS-1的酪氨酸磷酸化水平、提高Akt和GSK3β的磷酸化水平、以及增加肌肉中GLUT4向細胞膜上的轉(zhuǎn)位

8、等調(diào)節(jié)作用相關(guān)。
　　 Rhein可促進3T3-L1脂肪細胞和C2C12成肌細胞的葡萄糖消耗,且呈劑量依賴性和時間依賴性。對高糖高胰島素誘導產(chǎn)生胰島素抵抗的IR-3T3-L1細胞模型和IR-C2C12肌細胞模型,Rhein可明顯增強其胰島素誘導的葡萄糖攝取能力、提高胰島素刺激下GLUT4向細胞膜上的轉(zhuǎn)位及p-Akt(Ser473)的表達。
　　 三、Rhein改善脂質(zhì)代謝的藥理作用及機制研究
　　 GFAT抑制劑

9、Rhein對3T3-L1脂肪細胞增殖和分化均具有抑制作用,與抑制3T3-L1細胞分化相關(guān)的PPARγ和C/EBPα蛋白及mRNA水平有關(guān)。Rhein還可降低高脂飼料誘導的肥胖小鼠的體重、白色脂肪重量和脂肪指數(shù),并抑制其白色脂肪組織中與脂肪生成相關(guān)的基因表達。
　　 Rhein可改善HFD小鼠非酒精性脂肪肝病,降低肝指數(shù)、血清ALT水平和肝脂的堆積；降低血清TC水平。抑制肝臟中脂質(zhì)合成的重要調(diào)節(jié)因子PPARγ及其轉(zhuǎn)錄激活因子PGC

10、-1α、抑制脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶-FAS和SCD-1、抑制脂質(zhì)生成相關(guān)基因ACCα、ap2和UCP2的mRNA水平,可能是Rhein改善HFD小鼠的肝臟脂代謝紊亂的主要作用機制。
　　 Rhein可降低HFD小鼠骨骼肌中甘油三酯含量。降低骨骼肌中CD36和FATP1的mRNA水平、增加CPT1的mRNA水平、增加AMPK的絲氨酸磷酸化水平,從而減少肌肉細胞脂肪酸吸收和促進脂肪酸在線粒體的氧化,可能是Rhein改善骨骼肌脂質(zhì)異位

11、堆積的主要作用機制。
　　 總之,本論文首先采用原核表達體系獲得重組的人GFAT蛋白,并建立了GFAT抑制劑的體外篩選方法:在篩選中發(fā)現(xiàn)了Rhein對GFAT的抑制作用。分別通過體外高表達GFAT的細胞模型、1型糖尿病及胰島素抵抗的動物模型,證明了Rhein對GFAT的抑制作用。其次,分別在高脂飼料誘導的胰島素抵抗的動物模型和高糖高胰島素誘導的胰島素抵抗的細胞模型上,觀察到Rhein改善胰島素抵抗的藥理作用并探討了其作用機制。最

12、后,在3T3-L1脂肪細胞模型上觀察到Rhein抑制脂肪細胞分化的作用；并通過抑制白色脂肪組織中與脂肪生成相關(guān)的基因表達,減輕高脂飼料誘導的肥胖小鼠的體重:通過抑制肝臟中脂質(zhì)合成相關(guān)因子,改善HFD小鼠非酒精性脂肪肝??；并通過減少肌肉細胞脂肪酸吸收和促進脂肪酸在線粒體的氧化,改善骨骼肌的脂質(zhì)異位堆積。
　　 本論文以GFAT作為胰島素增敏的新靶點,從尋找高效高選擇性的GFAT抑制劑出發(fā),為胰島素抵抗合并脂代謝紊亂防治開辟了新的途