高效合成s-腺苷同型半胱氨酸的雙酶體系及其應用的研究.pdf

1、S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）是一種氨基酸衍生物，在生物體內與抗病性相關，是對相關病理障礙進行早期診斷的重要指標。外源SAH有鎮(zhèn)靜劑作用，是有效的安眠藥和抗驚厥藥物，同時也是一種抗病毒因子。隨著SAH在醫(yī)學領域的廣泛研究與應用，其高效生產(chǎn)制備技術也成為近年國內外研究的熱點課題。
　　本文將來源于極端嗜熱菌屬海棲熱袍桿菌Thermotoga maritima MSB8編碼的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的結構基因sahase和乳酸脫氫酶

2、的結構基因ldh分別與新型熱激質粒pHsh連接，得到重組質粒pHsh-sahase，pHsh-ldh。將重組質粒pHsh-sahase，pHsh-ldh分別轉入到大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL和BL21(DE3)中進行表達，得到了極耐熱性S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)和極耐熱性乳酸脫氫酶(LDH)。對重組菌(pHsh-sahase)產(chǎn)生的重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶進行純化，經(jīng)過熱處理、Ni離子親和

3、柱層析兩步純化得到電泳純級的蛋白，并對純酶的酶學性質進行了分析。對重組菌(pHsh-ldh)產(chǎn)生的重組乳酸脫氫酶進行純化，經(jīng)過熱處理、DEAE-Sepharose FF陰離子柱兩步純化得到電泳純級的蛋白，并對純酶的酶學性質進行了分析。
　　對Tm-SAHase的酶學性質研究發(fā)現(xiàn)，該酶是一種NAD依賴型酶，在反應過程中需要要消耗大量NAD。在1mMNAD下，該酶的最適反應溫度為85℃，最適反應pH為8.5，90℃酶活半衰期為1.5

4、h。在8mM NAD下，該酶的最適反應溫度高于100℃，最適pH為11.2。在工業(yè)生產(chǎn)常用溫度60℃下，該酶能夠長時間保持穩(wěn)定，并具有較高的酶活力。SDS-PAGE結果顯示該重組酶的分子量為45kD，與理論值相符。
　　對Tm-LDH的酶學性質研究發(fā)現(xiàn)，該酶的最適反應溫度為95℃，最適pH7.0;純酶在90℃的半衰期為2h，在pH5.5～8.0之間最穩(wěn)定;SDS-PAGE結果顯示分子量為33 kD，與理論推算值相吻合。以丙酮酸和N

5、ADH為底物時，相對于丙酮酸的Km值1.7 mmo l/L，Vmax為3.8×104 U/mg;相對于NADH的Km值7.2mmol/L，Vmax值為1.1×105 U/mg。Tm-LDH基因在T7載體中未能實現(xiàn)高效表達，但是在熱激載體pHsh中得到了可溶性超量表達，表達水平達到340 mg/L。該酶在65℃反應條件下，活性達到最高活性的50％，并能保持活性不變，這使該酶能夠與常溫酶匹配，在輔酶NAD再生體系的建立中具有廣泛的用途。

6、r>　　本研究首次采用重組極耐熱性Tm-SAHase進行SAH的酶法生產(chǎn)，在最適的生產(chǎn)條件下，0.5mg的Tm-SAHase可催化合成24μmol SAH。為了減少SAH生產(chǎn)過程中輔酶NAD的需求量，同時使Tm-SAHase維持較高的酶活性和穩(wěn)定性，我們使用海棲熱袍菌來源的重組極耐熱性LDH與Tm-SAHase配伍，構建輔酶NAD再生系統(tǒng)，使SAH的產(chǎn)量在相同生產(chǎn)條件下較單酶系統(tǒng)提高了6倍。因此，海棲熱袍菌來源的極耐熱性SAHase和L