一株產(chǎn)同型半胱氨酸酶菌株的分離及產(chǎn)酶條件研究.pdf

1、同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)即2-氨基-4-巰基丁酸，又稱高半胱氨酸，是一種含硫氨基酸，是甲硫氨酸(Met)代謝的中間產(chǎn)物。近年來，人們?nèi)找孀⒁獾饺梭w內(nèi)的Hcy水平與健康之間的關(guān)系密切。Hcy作為一個獨立的心血管疾病的風(fēng)險指標已被廣泛接受。Hcy的測定對預(yù)防和治療心血管疾病和其他與Hcy水平相關(guān)的疾病有重要的臨床意義。目前，血漿Hcy的測定主要采用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)及熒光偏振免疫技術(shù)來進行，但由于時間和價格

2、因素，這些方法僅在大醫(yī)院或檢驗中心應(yīng)用。而酶促比色法與以上方法相比具有更便宜、簡捷的特點，因此如能應(yīng)用于同型半胱氨酸的測定，將是一種更理想的方法。 在酶促比色法中，同型半胱氨酸酶(EC4.4.1.2)是所需要的一個必需的酶，因此它的性質(zhì)對該方法的使用和推廣非常重要。雖然已有少量文獻對此類酶進行了報道，但在這些已報道的酶中，大多數(shù)都存在著專一性不高的問題。 本研究從土壤中分離篩選到一株產(chǎn)同型半胱氨酸酶菌株N2-1，對其進行

3、了系統(tǒng)地分類學(xué)鑒定，并研究了該菌株產(chǎn)同型半胱氨酸酶的發(fā)酵條件，對粗酶的一些性質(zhì)進行了研究。主要實驗結(jié)果如下： 1、菌株的篩選及鑒定經(jīng)過富集培養(yǎng)劃線分離純化后，得到5株產(chǎn)同型半胱氨酸酶菌株，通過對酶活性和專一性的分析，菌株N2-1表現(xiàn)出較高的同型半胱氨酸酶活性和專一性，因此確定菌株N2-1為最佳產(chǎn)酶菌株。通過對該菌株的形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特性測定及16SrDNA測序和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定菌株N2-1屬于沙雷氏菌屬(Serratias

4、p.)。 2、菌株產(chǎn)酶發(fā)酵研究對菌株N2-1產(chǎn)酶發(fā)酵的條件進行了研究。研究采用搖瓶培養(yǎng)試驗，以測定菌體生長量、酶活性為指標，確定了該菌株產(chǎn)酶發(fā)酵的最佳條件為，培養(yǎng)基組成：0.5％蛋氨酸，4.0％酵母膏，1.4％葡萄糖，0.2％K2HPO4·3H2O，0.05％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，1.0％(v/v)微量元素溶液(5.2％ZnSO4，5.0％FeSO4·7H2O，5.0％CuSO4·7H2O和0.05％Mn

5、SO4·H2O)，pH6.5。培養(yǎng)溫度30℃，裝液量為100ml三角瓶中裝20ml培養(yǎng)基，于120rpm轉(zhuǎn)速下恒溫培養(yǎng)36h。在上述培養(yǎng)條件下發(fā)酵，發(fā)酵液的酶活可達0.933(OD670)。 3、粗酶液的性質(zhì)研究對菌株N2-1的粗酶液的兩個重要特性進行了研究。首先是磷酸吡哆醛(PLP)對酶活的影響，發(fā)現(xiàn)加入10μmol/LPLP可以提高活性35％，而對半胱氨酸酶活性提高達167％。其次是粗酶液的熱穩(wěn)定性試驗，發(fā)現(xiàn)其中的同型半胱氨