一株產(chǎn)肌酐水解酶菌株的分離及酶特性研究.pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文一株產(chǎn)肌酐水解酶菌株的分離及酶特性研究姓名：趙更峰申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：馬曉航;賈小明20030501微生物學(xué)碩士論文 摘要摘要肌酐是人體代謝的一種重要產(chǎn)物，一般通過(guò)腎臟的代謝排出體外。在臨床測(cè)定中，血清中的肌酐濃度是一項(xiàng)判斷腎功能的重要指標(biāo)。目前肌酐的測(cè)定一般是用J a 虢法進(jìn)行測(cè)定，該方法是基于化學(xué)反應(yīng)基礎(chǔ)上的，特異性差，血清中許多化學(xué)物質(zhì)都能干擾測(cè)定結(jié)果，給疾病的正確診斷造成了困難。而酶促的

2、催化反應(yīng)比一般化學(xué)反應(yīng)具有更高的專一性，因而近年來(lái)人們寄希望于研究開發(fā)出酶促肌酐的測(cè)定方法，以提高測(cè)定結(jié)果的可靠性。本文分離篩選到一株產(chǎn)肌酐水解酶的菌株4 2 ．1 ，經(jīng)鑒定為節(jié)桿菌屬，研究了菌株的產(chǎn)酶發(fā)酵條件、酶的提取純化方法及酶的性質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果分述如下：1 ．菌株的分離篩選及鑒定：經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)和劃線分離純化后，得到7 株產(chǎn)肌酐水解酶的菌，分別為菌株4 2 ．1 、4 2 ．2 、3 0 - l 、A l l 、S A O - C 、

3、S A O - I 、S A O —S 。通過(guò)產(chǎn)酶活性及酶熱穩(wěn)定性測(cè)定，菌株4 2 ．1 表現(xiàn)較高的酶活性且所產(chǎn)的肌酐水解酶具有較好的熱穩(wěn)定性，因此確定菌株4 2 ．1 為最佳產(chǎn)肌酐水解酶菌株。菌株4 2 ．1 的形態(tài)學(xué)、生理生化及1 6 s r R N A 序列比對(duì)結(jié)果表明該菌為節(jié)桿菌口，肪陽(yáng)6 日c 招rs p ．) 。2 ．菌株產(chǎn)酶條件：菌株4 2 ．1 的最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：肌酸，4 9 ；酵母膏，7 ．2 9 ；玉米漿，4 ．8

4、 9 ；葡萄糖，1 0 9 ；K 2 H P 0 43 H 2 0 ，2 9 ；K H 2 P 0 4 ，0 ．5 9 ；M g s 0 4 ‘7 H 2 0 ，O ．1 9 ；K C l ，O ．0 0 0 5 9 ；M 1 1 c 1 2 ，O ．1 9 ：水，1 0 0 0 m L ：p H7 ．5 。最適產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)溫度2 0 ℃，1 0 0 m L 三角瓶裝1 5 m L 培養(yǎng)基，于1 2 0 甲m 轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)3 6 h

5、。3 ．酶的提取純化：肌酐水解酶經(jīng)5 5 ℃水浴保溫3 0 r n i n 去除熱不穩(wěn)定蛋白后，在硫酸銨飽和度為3 0 ～5 0 ％之間大部分沉淀下來(lái)，經(jīng)過(guò)D E A E - C e l l u l o s e 離子交換、1 ’0 y o p e a r lH W ．6 5 C 疏水層析后，酶提純了1 4 5 倍，比活力達(dá)2 0 9 U ／I n g 。聚丙烯酰胺凝膠電泳( P A G E ) 顯示為一條帶，s D S ．P A G E

6、 測(cè)定亞基分子量為3 l0 0 0 D a 。4 ．酶的性質(zhì)：酶的最適p H 為7 ．5 ，最適作用溫度為6 0 ℃；在p H 6 ．0 —9 ．0 、6 0 ℃以下穩(wěn)定；對(duì)肌酐和肌酸的K m 值分別為2 1 ．1 4 m m o l 幾，4 0 ．8 m 0 1 ／L ；A r 、H g n 和鄰菲羅啉能使酶完全喪失活性，C u 2 ．、L i + 對(duì)酶活性有明顯的抑制作用，c 0 2 + 、M n 2 + 對(duì)酶活性有明顯促進(jìn)作用，表