一株產(chǎn)蛋白酶海洋菌的鑒定、產(chǎn)酶條件優(yōu)化和酶的性質(zhì)研究.pdf

1、微生物蛋白酶是一種在洗滌、皮革、銀洗、醫(yī)藥、食品、飼料、化工和廢處理上都有極強(qiáng)大工業(yè)應(yīng)用潛力的酶。本論文以實(shí)驗(yàn)室從南海海域海水中分離得到的一株產(chǎn)蛋白酶的海洋微生物NSB-2為研究對象，對該菌種進(jìn)行了鑒定、產(chǎn)酶條件優(yōu)化;以初純的酶液為研究對象，進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性研究，并開展了液體酶保護(hù)劑的研究，以期為今后的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　1、通過對菌株NSB-2進(jìn)行顯微鏡和電鏡掃描形態(tài)觀察，生理生化分析和16SrDNA基因序列測定及同

2、源性分析，初步確定產(chǎn)蛋白酶菌株NSB-2為芽孢桿菌屬，GenBank登陸號為JX240363;該菌為革蘭氏陽性細(xì)菌，菌體長約2-3微米，適宜的生長pH范圍為5.0-11.0，生長溫度范圍較寬，在4℃-50℃環(huán)境下均可良好生長。
　　2、采用單因素和中心組合試驗(yàn)對菌株NSB-2產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基和搖瓶條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選最佳碳氮源及其最適濃度，并依次優(yōu)化初始pH、接種量、種齡、裝液量、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速。研究結(jié)果表明:當(dāng)

3、酶活達(dá)到最高值時(shí)，各單因素的值分別為麩皮50 g/L、豆面40 g/L，氯化鈉5g/L，硫酸鎂1.5g/L，接種量4％，起始pH7.0，裝液量40mL，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速180rpm;利用中心組合實(shí)驗(yàn)(CCD)對發(fā)酵培養(yǎng)基的3個(gè)主要成分進(jìn)行組合設(shè)計(jì)，采用Design Expert8.05軟件分析獲得了主要因素的最優(yōu)條件，即麩皮濃度53.2g/L，豆面濃度38.2 g/L、氯化鈉3.0 g/L;以優(yōu)化的最優(yōu)條件為參數(shù)，預(yù)測最高酶活力為6

4、466.8U/ml，試驗(yàn)獲得酶活可達(dá)6346 U/ml，其實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值基本相符，說明預(yù)測模型可應(yīng)用于蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化。相比最初產(chǎn)酶活性提高了近7倍
　　3、采用硫酸銨沉淀和膜分離進(jìn)行了酶的初步分離純化，對初步純化的酶液進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究。結(jié)果表明:該酶可被蛋白酶抑制劑PMSF嚴(yán)重抑制，因此該酶隸屬于絲氨酸蛋白酶家族;其最適作用溫度為50℃，最適作用pH為10.0;該酶在40℃、pH10.0條件下穩(wěn)定性很好，4h幾乎沒有損失

5、;Ca2+、Mg2+、Ba2+、K+、Co2+對酶活性沒有影響，Al3+、Li+、Fe2+、EDTA能夠一定程度的抑制蛋白酶的酶活，F(xiàn)e3+、Zn2+、Ag+、Cu2+會(huì)嚴(yán)重影響該蛋白酶的活性;EDTA和常用表面活性劑SDS、TritonX-100、吐溫40和吐溫60對酶活性影響不大，顯示該酶作為洗滌添加酶具有良好的應(yīng)用前景。
　　4、開展了糖類、多元醇和金屬離子對該酶穩(wěn)定性保護(hù)作用的研究，結(jié)果顯示，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，對酶的熱穩(wěn)定性有