SCF-E3泛素連接酶亞基RBX1在鞭毛-纖毛解聚及食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、蛋白質(zhì)的泛素化是細(xì)胞內(nèi)降解蛋白質(zhì)的主要途徑，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）降解了胞內(nèi)約80％的蛋白質(zhì)且本身具有高度的特異性。泛素化過(guò)程需要泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3的共同作用。SCF-E3泛素連接酶是E3泛素連接酶中最大的家族，在UPS中主要負(fù)責(zé)識(shí)別大量特異性靶蛋白，參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)多種生理過(guò)程，包括調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)﹑細(xì)胞周期﹑細(xì)胞凋亡﹑DNA修復(fù)等過(guò)程。目前的一些研究證

2、明蛋白酶體參與鞭毛/纖毛的解聚過(guò)程，因此我們推斷同樣參與蛋白降解的泛素連接酶可能也參與到這一過(guò)程。
　　鞭毛和纖毛在進(jìn)化上十分保守并且擁有十分類似的結(jié)構(gòu)，是一種細(xì)胞基體突出于細(xì)胞表面的細(xì)胞器。鞭毛和纖毛不僅能夠作為細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)推進(jìn)器，也可以作為細(xì)胞感受器，接受外界環(huán)境或周圍細(xì)胞的生化信號(hào)并傳遞到細(xì)胞內(nèi)。已有研究表明人類幾乎所有的細(xì)胞都具有纖毛，然而人類細(xì)胞纖毛較短且不容易處理，故不易作為研究對(duì)象。在模式生物衣藻中鞭毛內(nèi)運(yùn)輸最早被發(fā)現(xiàn)

3、，隨后這種機(jī)制也被證明存在于高等動(dòng)物纖毛中。一些信號(hào)通路中重要的信號(hào)分子受體也存在于纖毛上，如PDGFαα受體，此外Wnt、Hedgehog和mTOR等信號(hào)通路也與纖毛有關(guān)。與正常細(xì)胞相比在腫瘤細(xì)胞中纖毛更容易丟失，目前在腎癌、食管癌、乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。然而纖毛在腫瘤中的缺失機(jī)制尚未完全清晰。鞭毛/纖毛的解聚需要大量纖毛相關(guān)蛋白的降解，雖然蛋白酶體已被證實(shí)參與纖毛的解聚，然而泛素連接酶相關(guān)蛋白是否參與纖毛的解聚，并

4、且影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展尚有待探索。杜氏鹽藻和衣藻同為真核單細(xì)胞綠藻，然而由于杜氏鹽藻鞭毛比衣藻鞭毛少了一層細(xì)胞壁，更適合作為研究鞭毛的模式細(xì)胞器，因而本實(shí)驗(yàn)以杜氏鹽藻鞭毛作為研究對(duì)象，來(lái)檢測(cè)E3泛素連接酶亞基RBX1（Ring box protein-1）與鞭毛間的關(guān)系
　　RBX1是SCF-E3泛素連接酶中的指環(huán)亞基，而SCF-E3泛素連接酶是最大的 E3連接酶家族，能夠調(diào)節(jié)多種生理生化過(guò)程。SCF-E3泛素連接酶能夠促進(jìn)多種細(xì)胞

5、內(nèi)蛋白的降解，包括一些轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子等。RBX1蛋白在N端結(jié)合cullins蛋白，在C端通過(guò)指環(huán)結(jié)構(gòu)域和連接泛素的泛素結(jié)合酶E2結(jié)合，最終催化將泛素轉(zhuǎn)移到目的蛋白進(jìn)而降解。研究發(fā)現(xiàn)在多種生物中，RBX1由于調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化對(duì)于許多生物的胚胎發(fā)育十分重要。此外，RBX1在多種腫瘤中發(fā)生過(guò)表達(dá)并且調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，如胃癌、肝癌以及膀胱癌等。為了了解E3泛素連接酶在纖毛中的功能，并尋找食管鱗癌的治療靶點(diǎn)

6、，本研究以杜氏鹽藻鞭毛作為模式細(xì)胞器，研究SCF-E3泛素連接酶亞基RBX1與鞭毛解聚間的關(guān)系，并進(jìn)而研究RBX1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞纖毛的影響以及對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　第一章杜氏鹽藻RBX1多克隆抗體的制備
　　目的：
　　為了探究杜氏鹽藻鞭毛解聚過(guò)程中SCF-E3泛素連接酶的變化，以杜氏鹽藻鞭毛為模式細(xì)胞器初步研究 RBX1是否參與杜氏鹽藻鞭毛的解聚，我們需要首先克隆杜氏鹽藻RBX1（DsRBX1）基因并制備抗體

7、。
　　方法:
　　依據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)引物克隆杜氏鹽藻RBX1基因cDNA片段，并應(yīng)用3’-RACE的方法克隆杜氏鹽藻RBX1基因3' cDNA末端，通過(guò)拼接獲得DsRBX1基因cDNA序列全長(zhǎng)，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物克隆基因全長(zhǎng)，測(cè)序驗(yàn)證并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。進(jìn)而將 DsRBX1基因 cDNA編碼區(qū)序列克隆到pET28a(+)載體上，得到重組表達(dá)載體pET28a-DsRBX1，轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)菌株BL21（DE3）中，

8、通過(guò)表達(dá)和純化得到DsRBX1蛋白。將DsRBX1蛋白與弗氏佐劑混合乳化，進(jìn)而對(duì)健康日本大耳兔進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射接種，第五次免疫后一周頸靜脈取血收集血清。利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中抗體的滴度。
　　結(jié)果：
　　依據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，克隆得到杜氏鹽藻RBX1基因cDNA片段504bp，并應(yīng)用3’-RACE的方法克隆杜氏鹽藻RBX1基因3' cDNA末端455 bp，通過(guò)拼接獲得DsRBX1基因cDNA序列全長(zhǎng)860 bp，經(jīng)過(guò)序

9、列分析，包含411 bp的開(kāi)放閱讀框。該序列能夠編碼136個(gè)氨基酸殘基，分子量約為14.8 kD。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，揭示該序列與已知的其它物種 RBX1具有高度同源性。將 DsRBX1基因 cDNA編碼區(qū)序列克隆到 pET28a(+)載體，得到重組表達(dá)載體pET28a-DsRBX1，轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)菌株 BL21（DE3）中，通過(guò)表達(dá)和純化得到DsRBX1蛋白。純化的蛋白用于制備多克隆抗體，利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)制備的血清中抗體的滴度，顯

10、示兔抗DsRBX1多抗的效價(jià)達(dá)到1:512000。
　　結(jié)論：
　　克隆得到在進(jìn)化中高度保守的 DsRBX1基因全長(zhǎng)序列，重組表達(dá)得到DsRBX1蛋白，進(jìn)而制備了DsRBX1的多克隆抗體。
　　第二章 RBX1對(duì)杜氏鹽藻鞭毛調(diào)控作用的初步研究
　　目的：
　　為了探究杜氏鹽藻鞭毛解聚過(guò)程中SCF-E3泛素連接酶的變化，以杜氏鹽藻鞭毛為模式細(xì)胞器初步研究SCF-E3泛素連接酶亞基RBX1是否參與杜氏鹽藻鞭毛的

11、解聚。
　　方法：
　　用收集得到的兔抗DsRBX1多克隆抗體，測(cè)定DsRBX1蛋白在杜氏鹽藻鞭毛經(jīng)1 mM IBMX誘導(dǎo)解聚后的變化。分別提取2小時(shí)內(nèi)鞭毛解聚后的杜氏鹽藻RNA和蛋白，從而檢測(cè)杜氏鹽藻鞭毛解聚時(shí)DsRBX1在RNA水平和蛋白水平上的變化。
　　結(jié)果：
　　IBMX誘導(dǎo)杜氏鹽藻鞭毛解聚后，杜氏鹽藻鞭毛在2小時(shí)后又基本恢復(fù)正常長(zhǎng)度。RT-PCR和Western blotting結(jié)果均顯示DsRBX1

12、蛋白顯著升高后又逐漸恢復(fù)正常水平。
　　結(jié)論：
　　在杜氏鹽藻鞭毛解聚過(guò)程中DsRBX1表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明DsRBX1參與杜氏鹽藻鞭毛的解聚。
　　第三章 RBX1在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用
　　目的：
　　為了研究SCF-E3泛素連接酶亞基RBX1在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們檢測(cè)了 RBX1在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，以及干擾后對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖凋亡及細(xì)胞纖毛的影響。
　　方法：
　　

13、通過(guò)Western blotting檢測(cè)RBX1蛋白在正常食管上皮細(xì)胞Het-1A和三株食管鱗癌細(xì)胞系EC9706、EC1、Eca109中的表達(dá)水平。構(gòu)建RBX1的shRNA慢病毒干擾三株食管鱗癌細(xì)胞中RBX1的表達(dá)，檢測(cè)對(duì)三株細(xì)胞增殖、周期、凋亡以及侵襲能力的影響，并檢測(cè)了RBX1干擾后食管鱗癌細(xì)胞中纖毛數(shù)量的變化。同時(shí)在裸鼠背部接種干擾RBX1后的食管鱗癌細(xì)胞EC9706，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，檢測(cè)干擾RBX1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞致瘤能力的

14、影響，致瘤三天左右開(kāi)始測(cè)量腫瘤大小，最終計(jì)算腫瘤抑制率及繪制腫瘤組織的生長(zhǎng)曲線，病理組織分析移植瘤的細(xì)胞形態(tài)并用TUNEL法檢測(cè)腫瘤組織的細(xì)胞凋亡水平。
　　結(jié)果：
　　Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，RBX1蛋白在三株食管鱗癌細(xì)胞系EC9706、EC1、Eca109中的表達(dá)量均高于正常食管上皮細(xì)胞Het-1A中的表達(dá)。shRNA慢病毒干擾三株食管鱗癌細(xì)胞中 RBX1的表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖及侵襲能力降低，細(xì)胞

15、凋亡率增加，同時(shí)檢測(cè)到干擾后食管鱗癌細(xì)胞中纖毛數(shù)量明顯恢復(fù)。在構(gòu)建的裸鼠移植瘤模型中，干擾RBX1后的食管鱗癌細(xì)胞EC9706生長(zhǎng)受抑制，腫瘤體積縮小到對(duì)照組的約1/2，病理組織檢測(cè)顯示成瘤細(xì)胞異質(zhì)性降低， TUNEL顯示干擾RBX1的組織中細(xì)胞凋亡增加。
　　結(jié)論：
　　RBX1蛋白在食管鱗癌細(xì)胞中表達(dá)增高，干擾RBX1的表達(dá)能顯著抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞的侵襲能力，并且細(xì)胞纖毛也明顯恢復(fù)，進(jìn)一步在構(gòu)建的裸鼠移

16、植瘤模型中干擾RBX1，食管鱗癌移植瘤體積明顯減小。
　　第四章 RBX1調(diào)控食管鱗癌發(fā)生的分子機(jī)制
　　目的：
　　為了研究SCF-E3泛素連接酶亞基RBX1在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們進(jìn)一步檢測(cè)了影響食管鱗癌細(xì)胞增殖凋亡及細(xì)胞纖毛變化的重要蛋白分子的變化。
　　方法：
　　通過(guò)Western blotting，分別檢測(cè)RBX1干擾后影響食管鱗癌細(xì)胞遷移的蛋白E-cadherin，影響細(xì)胞凋亡的抗凋亡

17、蛋白Bcl-2及影響細(xì)胞纖毛的纖毛相關(guān)蛋白Aurora A，并檢測(cè)mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)情況，進(jìn)一步通過(guò)在正常食管上皮細(xì)胞Het-1A中過(guò)表達(dá)RBX1檢測(cè)對(duì)mTOR信號(hào)通路的影響。
　　結(jié)果：
　　通過(guò)Western blotting檢測(cè)顯示，與shCon干擾后的食管鱗癌細(xì)胞相比， E-cadherin在shRBX1干擾后的細(xì)胞中表達(dá)明顯升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)，而mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵分子Akt,