E3泛素化連接酶NEDD4-1調(diào)控PTEN參與肺腺癌發(fā)生發(fā)展和化療耐藥的研究.pdf

1、研究背景：肺癌是危害人類健康的最常見腫瘤之一，高居惡性腫瘤的首位，近年來在世界范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率都呈急劇上升的趨勢。非小細胞肺癌(no small cell carcinoma，NSCLC)占所有肺惡性腫瘤的80％，其中腺癌(adenocarcinoma，ADC)占NSCLC的60％，因此肺腺癌是NSCLC最常見的病理組織學類型。肺癌的傳統(tǒng)治療以手術切除輔以放化療為主，近十年來分子靶向治療在改善NSCLC特別是肺腺癌患者預后方面取得了

2、巨大的進展，有效的延長了患者的生存時間。但是，即使治療的手段不斷進步，肺腺癌患者的5年總生存率仍低于30％，即使是肺腺癌Ⅰ期的完整切除腫瘤的患者，腫瘤的復發(fā)仍占有很大的比例（約30％）;而大多數(shù)肺腺癌患者在確診時即為晚期，因此傳統(tǒng)化療在晚期肺腺癌患者的治療策略中占有主導地位。部分肺腺癌患者對放化療甚至靶向藥物產(chǎn)生的耐藥現(xiàn)象，尤其是多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)表型的出現(xiàn)依然仍是患者化療失敗和預后不良的重要分

3、子事件之一。因此，尋找促進肺癌發(fā)生發(fā)展的新的分子機制，明確新的分子靶點和逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥的方法是預防復發(fā)轉(zhuǎn)移和改善肺腺癌預后的有益探索。
　　肺癌的發(fā)生發(fā)展和耐藥發(fā)生機制復雜，涉及到多種抑癌基因和癌基因的表達失調(diào)。目前，細胞信號傳到通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤耐藥的關系成為肺癌研究的新亮點。其中PTEN-PI3K/Akt細胞信號通路是細胞內(nèi)重要的信號傳導通路之一，多種生長因子激活通路中的關鍵蛋白活化PI3K，使Akt磷酸化激活下游

4、的多種靶基因，如BAD、mTOR、FKHR、GSK3β和MDM2等，從而促進細胞存活、生長、增殖和惡性轉(zhuǎn)化等生物學過程和表型，與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展和預后關系密切。抑癌基因PTEN(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)是這一通路的抑制分子，能通過使第二信使PIP3脫磷酸化為PIP2，拮抗PI3K/Akt細胞信號通路信號傳遞過程而發(fā)揮其抑癌作用。在肺腺癌中，

5、PTEN的失表達率可達30～50％，是肺腺癌發(fā)生早期最常見的分子事件，失活機制除了基因突變和缺失之外，翻譯后修飾可能也是其失活的重要機制。PTEN的泛素化是其在胞質(zhì)泛素-蛋白酶體系中降解和影響蛋白穩(wěn)定性的主要翻譯后修飾過程，這一過程的增強可能是PTEN缺失表達的機制之一。由于PTEN-PI3K/Akt通路在諸多信號傳導途徑中的中心地位備受關注，目前認為，肺腺癌細胞中PTEN失活介導PI3K/Akt信號通路活化，是促進腫瘤細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化

6、和化療耐受的重要機制，這一通路異常還與患者的不良預后密切相關。
　　NEDD4-1(Neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated4，NEDD4-1)是NEDD家族成員之一，是一種E3泛素化連接酶，可通過其協(xié)同蛋白Ndfip1等共同作用下使PTEN發(fā)生泛素化，多泛素化促進PTEN在胞質(zhì)中的降解，單泛素化可發(fā)生細胞核轉(zhuǎn)入，從而調(diào)控PTEN的穩(wěn)定性和亞細胞定

7、位，因此NEDD4-1介導的泛素化可能是調(diào)控PTEN的翻譯后修飾的主要機制。多項研究證實，NEDD4-1的高表達和PTEN的表達缺失存在于大多數(shù)人類惡性實體腫瘤組織中，并與腫瘤的進展和化療敏感性密切相關。新近研究發(fā)現(xiàn)NEDD4-1是某些惡性腫瘤，如前列腺癌、乳腺癌等患者的獨立的預后因子。但是，NEDD4-1在肺腺癌中的表達和預后意義尚未可知，參與調(diào)控PTEN的表達以及對化療耐受的關系和機制的研究鮮見報道。
　　研究目的：研究泛素化

8、E3連接酶NEDD4-1在肺腺癌組織中的表達，及其與浸潤轉(zhuǎn)移和化療敏感性等多種臨床病理因素之間的相關性，并初步探討其提示肺腺癌患者預后的價值。采用肺腺癌細胞株A549和耐藥細胞A549/DDP細胞，通過轉(zhuǎn)染特異性siRNA沉默NEDD4-1的表達，探討對肺腺癌敏感細胞A549和多藥耐藥細胞A549/DDP的生長、凋亡、浸潤遷移能力、EMT表型以及對化療藥物的敏感性的影響;初步分析NEDD4-1沉默對PTEN-PI3K/Akt信號傳導通路

9、的活性的調(diào)控作用和機制;探討NEDD4-1沉默對耐藥蛋白P-糖蛋白、LRP和MRP等的耐藥相關蛋白的表達的影響;研究對NF-κb和AP-1等細胞轉(zhuǎn)錄因子在此調(diào)控過程中的影響;為肺腺癌的靶向性基因治療和耐藥逆轉(zhuǎn)提供理論基礎和依據(jù)。
　　研究方法：采用免疫組織化學的方法回顧性分析研究了135例肺腺癌組織及對應癌旁組織中NEDD4-1、PTEN和p-Akt的表達，同時采用Western Blot和RT-PCR的方法研究了20例新鮮肺腺癌

10、組織中的表達，分析蛋白之間的相互表達關系及與各臨床病理因素和預后的關系和臨床意義。培養(yǎng)肺腺癌細胞系A549和耐藥細胞A549/DDP，轉(zhuǎn)染NEDD4-1的siRNA進行蛋白沉默，采用MTS方法檢測細胞生存活性和對順鉑和紫杉醇等化療藥物的敏感性，Transwell小室和瓊脂糖實驗檢測細胞干預前后遷移和浸潤能力的改變，采用流式細胞學檢測細胞凋亡，實時定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染siNEDD4-1沉默效率和靶基因mRNA水平的表達，Western

11、 blot檢測沉默前后細胞內(nèi)NEDD4-1、PTEN、p-Akt和NF-kB的表達分析對PTEN-PI3K/Akt細胞信號通路分子的影響。
　　研究結(jié)果：1.NEDD4-1在肺腺癌組織中呈顯著高表達狀態(tài)，而在周圍肺腫瘤肺組織中呈弱表達或陰性表達(P＜0.01)。分析結(jié)果顯示，NEDD4-1高表達與患者的肺門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、TNM分期和化療耐受等臨床病理因素密切相關(P分別＜0.05)，而與其他多種臨床病理學因素均不相關。
　

12、　2.SiRNA介導的NEDD4-1沉默誘導肺腺癌敏感細胞A549細胞生長抑制，抑制率為42.97±3.04％;促進細胞發(fā)生凋亡;Transwell小室檢測顯示siNEDD4-1導致A549細胞的浸潤和遷移能力明顯下降;Western blot檢測發(fā)現(xiàn)NEDD4-1沉默增加了A549細胞質(zhì)中PTEN的表達水平，同時激光共聚焦檢測實驗結(jié)果顯示沉默后胞漿內(nèi)PTEN和細胞核內(nèi)PTEN熒光信號較對照組均有不同程度增強，而免疫沉淀顯示PTEN泛素

13、化水平降低。NEDD4-1沉默后細胞內(nèi)p-Akt的活化程度降低，從而阻斷了PI3K/Akt細胞信號通路的活性，并調(diào)控其下游的多種靶蛋白的表達，如檢測凋亡蛋白BAD表達升高，mTOR磷酸化水平降低，細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB p65蛋白表達降低。
　　研究結(jié)論：1.肺腺癌中NEDD4-1和p-Akt表達較周圍肺組織明顯上調(diào)，而PTEN表達缺失，三者均與肺腺癌的腫瘤進展和化療耐受相關，多因素分析顯示NEDD4-1高表達和PTEN低表達均

14、與肺腺癌患者的不良預后有關。本結(jié)果提示NEDD4-1表達上調(diào)可能是肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的常見分子事件，其高表達可能與肺腺癌患者的耐藥表型出現(xiàn)密切相關，可能是預測肺腺癌患者預后的因子之一。
　　2.SiNEDD4-1對肺腺癌NEDD4-1的沉默能有效的降低A549細胞內(nèi)NEDD4-1的表達，抑制肺腺癌細胞A549的生長，增加細胞凋亡，細胞的浸潤和遷移能力都明顯降低，提示NEDD4-1表達上調(diào)可能促進肺腺癌細胞生長存活和的浸潤轉(zhuǎn)移過程，與

15、腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移能力及預后相關。NEDD4-1可能是促進細胞惡性表型的一種原癌基因。
　　3.SiNEDD4-1對肺腺癌細胞NEDD4-1沉默后，細胞質(zhì)PTEN表達增加而泛素化水平下降，并見在細胞質(zhì)和細胞核中聚集量增加，這能有效下調(diào)磷酸化p-Akt水平，提示NEDD4-1介導的PTEN泛素化通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用。此外，其下游靶蛋白BAD表達上調(diào)，磷酸化mTOR下調(diào)以及細胞錄因子NF-Kb p65亞單位表達表達水平下降

16、，均提示NEDD4-1表達上調(diào)通過泛素化過程拮抗PTEN的抗癌作用，活化PI3K/Akt細胞信號通路及其下游靶蛋白來誘導肺腺癌細胞生長存活和出現(xiàn)化療耐受表型。
　　4.SiNEDD4-1對肺腺癌細胞NEDD4-1轉(zhuǎn)染沉默后，A549/DDP細胞對順鉑和紫杉醇的敏感性均不同程度的增加，并檢測到多藥耐藥蛋白P-gp、MRP和LRP的表達降低，提示NEDD4-1沉默能部分的提高肺腺癌細胞對化療藥物的敏感性，并可能通過調(diào)節(jié)PTEN增加凋亡

17、、抑制EMT表型或降低耐藥相關蛋白的表達部分逆轉(zhuǎn)A549/DDP細胞的耐藥性，這一結(jié)論提示NEDD4-1可能成為逆轉(zhuǎn)肺腺癌化療耐藥的分子靶蛋白，其小分子抑制劑的研究為肺腺癌的治療提供了新的思路和方法。
　　總之，NEDD4-1在肺癌組織中高表達通過泛素化拮抗PTEN的活性，活化了PI3K/Akt細胞信號通路并作用于多種靶蛋白，從而促進了肺腺癌細胞的生長，浸潤和遷移過程，同時還增加了肺腺癌細胞對于化療藥物的耐受性，并部分的促進了肺多