CRL4-CRBN E3泛素連接酶底物的定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定.pdf

1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位證書而使用過的材料。對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。論文作者簽名：—工悱日期：j撼L出cI姒CⅪjNE3泛素連接酶底物的定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定中文摘要CI也4CRBN

2、E3泛素連接酶底物的定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定中文摘要研究背景和目的：精神發(fā)育遲滯是一種智力障礙疾病，不僅嚴(yán)重影響了患者自理能力以及生活質(zhì)量，同時也造成了沉重的社會壓力。該疾病的發(fā)病原因多樣，可由一系列的基因缺陷引起。研究發(fā)現(xiàn)Cefeblon(CRBN)基因的無義突變使翻譯過程過早地在第419個氨基酸的位置引入一個終止密碼子，從而產(chǎn)生CRBNR419X這一突變體。這種無義突變會導(dǎo)致兒童精神發(fā)育遲滯的發(fā)生。然而，對CRBN突變引發(fā)精神發(fā)育遲滯的詳

3、細(xì)分子機(jī)制，一直以來都不清楚。前人的研究已經(jīng)證實(shí)該蛋白質(zhì)能與DDB1、ROC1、Cullin4A形成一個CullinIm叮GE3Ligase，即C剛4CI①N泛素連接酶。本課題主要對先天性精神發(fā)育遲滯相關(guān)的C砌4CI國NE3泛素連接酶底物進(jìn)行鑒定，并對該泛素連接酶的功能進(jìn)行研究，探索疾病發(fā)病機(jī)制和可能的治療途徑。研究方法：構(gòu)建表達(dá)GFP、野生型ClmN叭(謝ldtype)、CRBNR419x突變體的慢病毒載體，感染人源細(xì)胞系實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)

4、。利用細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(S幾AC)分別將三種細(xì)胞用含有不同穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸培養(yǎng)基培養(yǎng)，將標(biāo)記完全的GFP，C砌jN叭表達(dá)細(xì)胞等量混合，利用胰蛋白酶消化并用質(zhì)譜對多肽進(jìn)行分析，通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索，篩選出在過表達(dá)GFP與CRBN叭的細(xì)胞中表達(dá)量發(fā)生明顯變化的蛋白質(zhì)，找出與精神發(fā)育遲滯相關(guān)的蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證，并運(yùn)用生物信息學(xué)的方法分析這些蛋白質(zhì)的功能。研究結(jié)果：我們通過SⅢAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出了在哺乳動物細(xì)

5、胞中受C恥烈調(diào)控的蛋白，并通過生物化學(xué)方法驗(yàn)證了其中幾種重要的蛋白。通過這些實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，CImN過表達(dá)可以下調(diào)各種具有不同生物學(xué)功能的蛋白，例如與細(xì)胞凋亡或神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的蛋白。我們的結(jié)果還發(fā)現(xiàn)CRBN可以與一些發(fā)生下調(diào)的蛋白相互作用，這些蛋白包括IJl)a5，轉(zhuǎn)錄因子AP一1，以及與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的蛋白NogoA。研究結(jié)論：通過細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)與定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CRBN可以顯著地下調(diào)Uba5、AP1及Nogo