大豆E3泛素連接酶基因GmAIRP1的克隆與功能鑒定.pdf

1、近年來(lái)，干旱、鹽堿以及低溫等非生物脅迫已經(jīng)成為威脅全球農(nóng)作物生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素，因此提高農(nóng)作物對(duì)非生物脅迫的耐受能力，有利于提高農(nóng)作物質(zhì)量與產(chǎn)量、有效利用耕地以及保障糧食安全。一些研究中發(fā)現(xiàn)，泛素/26S蛋白酶體途徑作為一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾途徑，不但對(duì)高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育極其重要，而且對(duì)植物抵御非生物脅迫也有重要作用。因此，發(fā)掘與該途徑有關(guān)的新基因，可以充實(shí)作物耐脅迫基因工程的基因資源，從而為分子育種提供參考。
　　本研究以具有豐富

2、抗逆基因的大豆栽培品種合豐45為材料，利用同源克隆技術(shù)，從大豆中克隆了一個(gè)與擬南芥AtAIRP1基因同源的RING-finger型E3泛素連接酶基因，通過(guò)生物信息學(xué)的方法分析了該基因的功能；利用半定量RT-PCR技術(shù)分析在不同非生物脅迫處理下該基因表達(dá)的差異；將該基因?qū)霟煵葜?，?duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗逆性分析，確定該基因與非生物脅迫抗性的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：
　　1. GmAIRP1基因的克隆與序列分析
　　根據(jù)擬南芥AtA

3、IRP1基因氨基酸序列在大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（www. Phytozome. com/soybean）中進(jìn)行同源序列檢索，將檢索出的同源序列通過(guò) RT-PCR的方法進(jìn)行克隆，并將該基因命名為GmAIRP1。該基因編碼了一個(gè)213個(gè)氨基酸的RING-H2型E3泛素連接酶，是一個(gè)新的RING-finger型E3泛素連接酶基因。
　　2. GmAIRP1基因在逆境脅迫和激素誘導(dǎo)下的表達(dá)模式分析
　　把大豆栽培品種合豐45幼苗分別用干旱

4、（20％ PEG6000）、鹽(200 mmol/L NaCl)和ABA(100μmol/L)進(jìn)行脅迫處理，取處理時(shí)間0、0.5、1、3、6、12、24h大豆葉片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，通過(guò)半定量RT-PCR分析GmAIRP1基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明三種處理?xiàng)l件均能誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，并在短時(shí)間內(nèi)表達(dá)量顯著提高。
　　3. GmAIRP1基因?qū)煵莸倪z傳轉(zhuǎn)化
　　構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121-GmAIRP1，

5、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草，獲得了表達(dá)GmAIRP1基因的陽(yáng)性植株。用200 mmol/L NaCl和200 mmol/L甘露醇處理轉(zhuǎn)基因煙草T0代。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株生長(zhǎng)量高，生長(zhǎng)狀態(tài)好。
　　4.轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性鑒定
　　用200 mmol/L NaCl和20%PEG6000處理轉(zhuǎn)基因煙草T0代，對(duì)兩組植株進(jìn)行了抗逆表型分析與POD、CAT、MDA、游離脯氨酸等生理指標(biāo)的測(cè)定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草的生