大豆泛素化系統(tǒng)E2和E3酶基因的克隆與功能研究.pdf

1、植物生長發(fā)育的許多過程都受到泛素-蛋白酶體途徑的調(diào)控。泛素-蛋白酶體途徑(UPP)是真核生物體內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解最為重要的途徑，包括兩個連續(xù)的過程:泛素化系統(tǒng)通過泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)的級聯(lián)反應(yīng)將泛素或多聚泛肽鏈連接到它的底物上;26S蛋白酶體降解泛素化蛋白。據(jù)估計擬南芥基因組編碼1300多種E3連接酶，其中36％的E3連接酶屬于RING結(jié)構(gòu)域蛋白。對這類蛋白基因的研究剛剛起步，目前報道的十幾種RIN

2、G型E3連接酶通過泛素介導的蛋白質(zhì)降解參與植物光形態(tài)建成、配子體發(fā)育、花發(fā)育、種子發(fā)育、激素的信號轉(zhuǎn)導、抗逆、抗蟲等方面的調(diào)控。
　　 大豆(Glycine max(L.)Merrill)是重要的植物蛋白與食用植物油的來源，但其生長發(fā)育常受到低溫、干旱和高鹽等逆境的脅迫。植物對各種脅迫會產(chǎn)生一系列的應(yīng)答反應(yīng)，其中泛素-蛋白酶體途徑(UPP)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究從大豆中首次克隆了RING蛋白基因GmRFP1，發(fā)現(xiàn)它的表達受

3、到逆境脅迫的影響，進一步對GmRFP1的功能做了分析。GmRFP1的克隆與功能研究對于大豆抗逆育種具有重要意義。
　　 本研究主要取得了以下研究進展:
　　 1.通過RT-PCR和RACE技術(shù)從大豆中克隆得到RING蛋白基因，命名為GmRFP1，GenBank注冊號為EU786799。序列分析表明GmRFP1全長1671bp，包括1179bp的完整ORF，編碼392個氨基酸殘基。蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)存在一個N端跨膜區(qū)和RIN

4、G保守結(jié)構(gòu)域。同源比對結(jié)果顯示GmRFP1蛋白與其它物種的同源蛋白在RING結(jié)構(gòu)域的一致率超過83.3％。為了分析GmRFP1基因的時空表達模式，本研究采用半定量RT-PCR方法檢測了GmRFP1在根、莖、莖尖、葉、花乖種子中的表達，發(fā)現(xiàn)GmRFP1基因為組成性表達;熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示GmRFP1的表達水平受低溫、高鹽、干旱脅迫以及ABA的影響:ABA和高鹽能誘導GmRFP1的表達;而在冷和干旱脅迫下表達量呈下降的趨勢，表明G

5、mRFP1是ABA和冷、干旱、鹽脅迫應(yīng)答基因。
　　 2.為了分析GmRFP1的蛋白功能，本研究構(gòu)建了原核表達載體pGEX4T-2/GmRFP1，同時針對RING結(jié)構(gòu)域的活性位點構(gòu)建了突變體，造成該結(jié)構(gòu)域中兩個保守半胱氨酸發(fā)生改變。兩種融合蛋白都在大腸桿菌中得到表達，純化后進行體外泛素連接酶活性檢測，發(fā)現(xiàn)GmRFP1融合蛋白能夠進行自主多聚泛素化反應(yīng)，而突變體蛋白則不能發(fā)生反應(yīng)。該實驗表明GmRFP1蛋白具有E3泛素連接酶活性，

6、并且RING結(jié)構(gòu)域的保守半胱氨酸對于其E3泛素連接酶活性是必需的，半胱氨酸的突變造成了E3連接酶活性的喪失。
　　 3.進一步構(gòu)建了GmRFP1基因的正義和反義表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草，獲得了過量表達GmRFP1基因和反義抑制GmRFP1基因表達的轉(zhuǎn)基因煙草植株;對轉(zhuǎn)基因植株的逆境適應(yīng)能力和ABA反應(yīng)進行了分析，發(fā)現(xiàn)過量表達GmRFP1基因使轉(zhuǎn)基因植株對ABA反應(yīng)敏感性降低，生長快，根長，側(cè)根多，對低溫的耐受能力也減弱

7、;抑制GmRFP1基因表達的轉(zhuǎn)基因植株則提高了對低溫的耐受能力，提示GmRFP1可能是ABA信號通路和低溫脅迫應(yīng)答信號途徑的負調(diào)節(jié)因子。
　　 4.為了探討GmRFP1調(diào)控低溫脅迫信號通路的可能機制，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學方法對野生型煙草、過量表達的轉(zhuǎn)基因煙草及抑制表達的轉(zhuǎn)基因煙草葉片的差異表達進行了研究，鑒定出6個表達量變化2倍以上的蛋白，即膜聯(lián)蛋白VCaB42、硫氧還蛋白H1、核糖體蛋白、葡萄糖-6磷酸脫氫酶、成熟酶K和轉(zhuǎn)錄延長因子

8、GreA;發(fā)現(xiàn)GmRFP1的抑制表達上調(diào)了低溫脅迫信號途徑相關(guān)的膜聯(lián)蛋白VCaB42、硫氧還蛋白H、核糖體蛋白和葡萄糖-6磷酸脫氫酶的表達量，這可能是反義GmRFP1轉(zhuǎn)基因煙草抗寒力增強的原因。
　　 4.從大豆中克隆了兩個泛素結(jié)合酶E2基因，分別命名為GmUBCc571和GmUBCc171。序列分析結(jié)果表明，它們的cDNA開放閱讀框長度均為447bp，編碼148個氨基酸，中部第85位是決定E2s活性的半胱氨酸殘基。表達譜分析表

9、明GmUBCc571只在莖、莖尖、葉、花中表達，在根和種子中不表達;而GmUBCc171呈組成性表達。通過實時定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)在ABA處理和低溫、高鹽脅迫條件下，GmUBCc571都存在兩次mRNA的積累過程，PEG脅迫下mRNA表達呈現(xiàn)升高的趨勢;GmUBCc171的表達不受ABA的誘導，而PEG和低溫脅迫誘導了它的表達，高鹽條件下存在兩次mRNA的積累過程。為了檢測GmUBCc571和GmUBCc171蛋白的泛素結(jié)合酶活性以及它