LSB-1噬菌體水解酶重組技術(shù)及應(yīng)用研究.pdf

1、2010年10月，世界多國報(bào)道了“超級(jí)細(xì)菌”("Super-bug”，一種耐藥革蘭氏陰性細(xì)菌，含NDM-1耐藥基因)引發(fā)感染并導(dǎo)致嚴(yán)重危害的事件。震撼全球的信息再一次將人類的目光聚焦到微生物的進(jìn)化與變異、耐藥與災(zāi)難，這一嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題上。近年來，伴隨著耐藥病原體的不斷出現(xiàn)，抗菌藥物和抗菌制劑的開發(fā)、應(yīng)用面臨前所未有的挑戰(zhàn)。突破傳統(tǒng)抗菌技術(shù)的機(jī)制，探索和建立新的抗菌技術(shù)是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一項(xiàng)迫切的任務(wù)。
　　 噬菌體，作為細(xì)菌的病毒，

2、能夠特異性的感染和裂解細(xì)菌，其裂解宿主菌的效應(yīng)和機(jī)制被研究者所關(guān)注。得益于豐富的生物特點(diǎn)，烈性(毒性)噬菌體形態(tài)各異，裂解宿主菌的方式多樣，作用過程巧妙而獨(dú)特，是新型抗菌技術(shù)和方法的重要仿生模板，將啟發(fā)我們更多的創(chuàng)新思維。
　　 噬菌體水解酶是噬菌體的關(guān)鍵溶菌成分，觀察和探索其結(jié)構(gòu)和功能對開發(fā)和應(yīng)用噬菌體生物酶有著重要意義?；诖?，本研究以前期研究中篩選獲得的新型噬菌體LSB-1為試驗(yàn)體，采用微生物學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等方

3、法對此株新型噬菌體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、以及歸類于水解酶系的唾液酸酶(endo-N)的基因及蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和分析。通過以噬菌體T7為載體的重組技術(shù)，進(jìn)一步使endo-N基因得到融合、表達(dá)。相關(guān)研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1.LSB-1噬菌體的生物性質(zhì)及分子特征：通過透射電鏡、一步生長曲線及核酸酶切電泳等技術(shù)對噬菌體LSB-1的生物性質(zhì)和分子特征進(jìn)行全面分析，確定LSB-1噬菌體有1個(gè)多面體立體對稱的頭部，直徑大約為50±5nm，尾絲長

4、約為60±5nm，屬于短尾噬菌體科(Podoviridae)。噬菌體的5min吸附率為94.3％，潛伏期是23min，平均釋放量為80個(gè)。經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheⅠ酶切產(chǎn)生2條清晰條帶，表明分子量在30kb左右。
　　 2.LSB-1噬菌體宿主識(shí)別與裂解關(guān)鍵酶的確定：利用Shotgun基因組測序、ORFFinder、blast、Sequin和MEGA4等系列生物信息分析技術(shù)，完成了噬菌體全基因組測序，驗(yàn)證了核酸大小約為30kp(ds

5、DNA)，有15個(gè)主要的功能基因，進(jìn)一步證實(shí)噬菌體了LSB-1為一株新的噬菌體；通過同源比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析和功能預(yù)測并發(fā)現(xiàn)編碼尾絲蛋白的gp17與噬菌體宿主識(shí)別及裂解功能有關(guān)，屬于endo-N。
　　 3.Endo-N的結(jié)構(gòu)分析：利用SOPMA、PDB、SWISS-MODEL、PHYRE、RasMol和CN3D4.1等信息分析技術(shù)對endo-N編碼gp17基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，構(gòu)建了LSB-1噬菌體gp1

6、7基因的三維結(jié)構(gòu)模型，并成功預(yù)測出其表面活性中心。發(fā)現(xiàn)其三維結(jié)構(gòu)由“Domain A”和“Domain B，”兩個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，N末端位于結(jié)構(gòu)域A，C末端位于結(jié)構(gòu)域B，整個(gè)酶分子結(jié)構(gòu)以β折疊為主。其蛋白表面正負(fù)電荷分布區(qū)域相差不大，整個(gè)蛋白分子表面電荷基本呈中性。其酶活性中心位于結(jié)構(gòu)域A中，由Glut405，Arg415和Arg487構(gòu)成活性中心。
　　 4.Gp17基因的克?。簩ndo-N的編碼基因gp17進(jìn)行擴(kuò)增，全長基因插

7、入原核表達(dá)載體噬菌體T7，成功構(gòu)建了含gp17的T7-LSB-gp17重組噬菌體。重組噬菌體純化后通過PCR擴(kuò)增到目的基因，經(jīng)DNA測序驗(yàn)證，結(jié)果與LSB-1噬菌體的gp17基因核苷酸序列一致，通過蛋白電泳分離出目的條帶，證實(shí)T7-LSB-gp17重組噬菌體構(gòu)建成功。
　　 5.噬菌體重組前后效應(yīng)觀察：利用稀釋、雙層瓊脂鋪板、挑取單個(gè)噬菌斑法對T7-LSB-gp17重組噬菌體進(jìn)行純化，采用終點(diǎn)滴定法測得重組噬菌體滴度(pfu/m

8、l)；重組噬菌體T7-LSB-gp17對大腸桿菌BLT5403、E.coli8401、E.coli285和EHEC O157，及其它種屬的金黃色葡萄球菌、臘樣芽胞桿菌繁殖體和類炭疽芽胞桿菌繁殖體均有明顯的溶菌效應(yīng)。
　　 綜上所述，本研究通過對大腸桿菌8401噬菌體LSB-1的分子特征進(jìn)行分析，認(rèn)識(shí)其屬于短尾病毒科，30kp的dsDNA噬菌體，存在19個(gè)主要的功能基因。其中獲得編碼endo-N的重要功能基因gp17，結(jié)合生物信息