重組Ig結合分子噬菌體展示文庫的構建及選擇研究.pdf

1、安徽醫(yī)科大學碩士學位論文重組Ig結合分子噬菌體展示文庫的構建及選擇研究姓名：徐容申請學位級別：碩士專業(yè)：病理學與病理生理學指導教師：鄧松華潘衛(wèi)20040401安徽醫(yī)科大學碩士學位論文中文摘要定向分子進化是探索研究生物大分子結構與功能的重要手段，同時也是改造、優(yōu)化生物大分子特性的有效方法。噬菌體展示及篩選和DNA重排是體外定向分子進化的重要核心技術。proteinA和proteinL是兩種不同的細菌表面蛋白，均可與Ig結合，但各自有不同的

2、特點。本研究應用DNA重排技術將proteinA的單個抗體結合結構域和proteinL的單個抗體結合結構域隨機組合，構建了重組Ig結合多肽PALn分子文庫，并采用噬菌體展示技術結合體外定向進化lgG親和篩選，探究Ig結合分子的結構和功能的關系，同時為定向改造Ig結合分子打下基礎。本研究分四個部分：一、新型噬菌體展示載體pCANTAB5S的構建：二、噬菌體展示Ig結合多肽PLn分子文庫的構建及篩選：三、噬菌體展示Ig結合多肽PALn分子文

3、庫的構建及篩選；四、(MDPLMDPA)n代表分子的原核表達、純化及功能鑒定。一、新型噬菌體展示載體pCANTAB5S的構建通過基因操作，將限制酶切位點SacI引入到噬菌體展示載體pCANTAB5L，并校正了pCANTAB5L載體StuI、SalI等位點的讀框。具體過程是：以pCANTAB5X—IFNa2b重組質粒為模板，在上游引物中引入XbaI、SacI酶切位點，在下游引物中引入SacI、StuI、salI酶切位點，將用該引物擴增的I

4、FNa2b銜接片段PCR產物克隆到pMDl8T中，再將該片段用XbaI和SalI酶切并將之插入pCANTAB5L的XbaI和SaII位點中，經SacI酶切，線性載體片段自連，構成新型噬菌體展示載體pCANTAB5S。序列分析證明pCANTAB5S在pCANTAB5L原有XbaI和StuI之間引入SacI位點，并校正了原StuI的讀框，有利于各種外源隨機多肽和功能蛋白的有效展示。二、噬菌體展示Ig結合多肽PLn分子文庫的構建及篩選用含Sa

5、cI位點的特定引物PCR擴增proteinL的B3抗體結合結構域(L)，SacI酶切后經DNA重排連接形成各種不同長度的PLn隨機分子庫，并將該文庫呈現在噬菌體表面，構建了噬菌體展示Ig結合多肽PLn文庫。所建肽庫容量為3105個菌落形成單位，滴度為6210YU／ml。通過三輪IgG親和篩選，選擇后的12個陽性克隆DNA測序分析顯示8個為2L序列，1個為L序列，證實了proteinL的單個B結構域具有Ig結合功能，2個重復protein