基于噬菌體展示技術(shù)的副豬嗜血桿菌的抗體文庫(kù)構(gòu)建.pdf

1、副豬嗜血桿菌是定居于豬的上呼吸道中機(jī)會(huì)性病原菌,在特定的條件下引發(fā)疾病。感染豬引起的疾病,稱(chēng)副豬嗜血桿菌病,也稱(chēng)為豬的革拉瑟氏病,以多發(fā)性漿液纖維性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎和心包炎為病理特征。近年來(lái)大規(guī)模爆發(fā)該病給各國(guó)各地區(qū)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而國(guó)內(nèi)外防制該病多采用傳統(tǒng)的全菌體疫苗和使用多品種大劑量抗生素。雖然在防制豬的革拉瑟氏病取得了一定的成效,但是,常常導(dǎo)致防制的失敗。因此,本研究擬采用近年來(lái)出現(xiàn)的噬菌體抗體展示技術(shù),建立副

2、豬嗜血桿菌抗體的噬菌體展示文庫(kù),試圖篩選針對(duì)性強(qiáng)的適用的預(yù)防及治療性抗體制劑,為制備針對(duì)副豬嗜血桿菌病的抗體開(kāi)辟新途徑。
　　 本研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.提取經(jīng)副豬嗜血桿菌滅活疫苗免疫后屠宰豬脾臟組織中總RNA,經(jīng)Oligo(dT)15反轉(zhuǎn)錄后,用豬的IgG可變區(qū)輕重鏈特異性引物擴(kuò)增可變區(qū)基因。擴(kuò)增到12條可變區(qū)基因,包括H鏈基因的5條序列,k鏈基因的5條序列和入鏈基因的2條序列。
　　 2.將12條序列

3、分別克隆到測(cè)序載體pMD19-T上進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與NCBI中豬的IgG的可變區(qū)序列比對(duì),均屬于豬的IgG的可變區(qū)序列。通過(guò)IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)中VQuest軟件比對(duì)分析可變區(qū)推導(dǎo)氨基酸的殘基,劃分為7區(qū),分別為FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。所有序列的CDR是可變的,尤其是CDR3。
　　 3.采用帶有l(wèi)inker接頭片段的引物,利用重疊延伸PCR組合了VH鏈和VL鏈的基因,組裝成6條scFv。

4、>　　 4.將6條scFv分別克隆到噬菌粒pC3C,用氯化鈣法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue,構(gòu)建了重組子pC3C-scFv。經(jīng)酶切鑒定,結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致,測(cè)序鑒定pC3C-scFv陽(yáng)性重組子,與預(yù)期結(jié)果99％以上相同。以輔助噬菌體VCSM13救援陽(yáng)性重組子,建立了噬菌體抗體庫(kù)。
　　 5.用IPTG誘導(dǎo)重組子pC3C-H2.2k1.1表達(dá)scFv,其表達(dá)產(chǎn)物的分子量大小約為30kDa。
　　 6.對(duì)重組子pC3C-