副粘病毒Tianjin株在嬰幼兒下呼吸道感染情況調(diào)查及噬菌體抗體文庫的構(gòu)建篩選.pdf

1、副粘病毒Tianjin株（Paramyxovirus Tianjin strain）是1999年從患呼吸道疾病死亡的普通棉耳狨猴肺組織分離得到的毒株，曾引起狨猴致死性感染。以滅活的全病毒為抗原采用ELISA方法檢測嬰幼兒呼吸道感染者血清中IgM，陽性率高達36．9%。考慮到狨猴與人類具有較近的親緣關(guān)系以及呼吸道感染者血清中抗體的高陽性率，提示該病毒株與人類的關(guān)系密切。 目的： 建立敏感、特異的副粘病毒Tianjin株檢測

2、方法，為了解該株病毒與人類的關(guān)系提供更為準確的數(shù)據(jù)；獲得單克隆抗體、基因工程抗體，為下一步進行診斷、治療，研究宿主親嗜性改變、突變蛋白與功能等奠定基礎。 方法： 本實驗分別采用雜交瘤單克隆抗體制備技術(shù)和噬菌體抗體庫技術(shù)，獲得副粘病毒Tianjin株的單克隆抗體；建立了敏感、特異的檢測病毒抗原的方法，并對嬰幼兒下呼吸道感染標本進行檢測。 結(jié)果： 1．采用雜交瘤技術(shù)制備副粘病毒Tianjn株HN蛋白單克隆抗體

3、（mAbs），共獲得了23株mAbs。其中較為特異的mAbs有3株，分別命名為G7H4D3、G7D9G3和G7G7E7。3株mAbs與副粘病毒Tianjin株有較高結(jié)合活性，與甲、乙型流感病毒、新城疫病毒（NDV）、人副流感病毒（hPIV）1型、3型、肺炎支原體均無交叉反應性。ELISA相加試驗和阻斷試驗表明，3株單抗識別相同或相近的表位區(qū)域，識別的表位在抗病毒免疫應答中處于免疫優(yōu)勢地位。 2．以兔抗副粘病毒Tianjin株多克

4、隆抗體為捕獲抗體，單抗G7G7E7為檢測抗體，建立雙抗體夾心ELISA法，檢測523例下呼吸道感染患兒支氣管肺泡灌洗液（BALF）標本。檢測陽性率為2．1%（11/523）。與RT-PCR和間接ELISA法相比，雙抗體夾心ELISA法具有敏感性高、特異性強的優(yōu)點，適于臨床檢測使用。檢測結(jié)果顯示，副粘病毒Tianjin株可能是嬰幼兒下呼吸道感染的重要致病因子之一。 3．構(gòu)建了以噬菌粒p3MH為載體，副粘病毒Tianjin株為免疫原

5、，庫容為1．18×107的鼠源性免疫噬菌體抗體庫。分別以純化病毒和重組蛋白HN為篩選抗原對構(gòu)建的噬菌體抗體庫進行了三輪吸附-洗脫-擴增的篩選富集，并挑取單菌落以ELISA方法進行初步檢測，獲得7株與副粘病毒Tianjin株有結(jié)合活性的陽性克隆。其中有6株單抗克隆制備了可溶性Fab抗體，可溶性Fab均識別副粘病毒Tianjin株，其中1株結(jié)合HN3（HN375aa～575aa）片段，2株結(jié)合HN2（HN253aa～452aa）片段。對單抗

6、克隆20進行測序，結(jié)果表明輕鏈V區(qū)基因?qū)賄K9亞群，重鏈V區(qū)基因?qū)賄H7亞群，經(jīng)NCBI BLAST和IMGT分析均為鼠源性抗體基因，最高同源性分別為94．87%和97．85%。 結(jié)論： 本實驗通過雜交瘤技術(shù)獲得了3株特異性單抗。建立了雙抗體夾心ELISA方法，并對呼吸道患兒標本進行了檢測。獲得了更為準確的副粘病毒Tianjin株在人群中感染狀況的資料。構(gòu)建了副粘病毒Tianjin株的免疫噬菌體抗體庫，并獲得6株單抗，為