副粘病毒Tianjin株NP基因的表達及在兒童下呼吸道感染檢測中的應用.pdf

1、1999年從呼吸道感染導致死亡的靈長類動物普通棉耳狨猴肺組織中分離到一株病毒，該毒株與普通棉耳狨猴下呼吸道感染之間符合科赫原則。分離株經電鏡觀察，具有典型的副粘病毒特征：交叉血凝抑制試驗、RT-PCR擴增HN基因并測序、生物信息學方法進行核酸序列的聯配檢索和系統(tǒng)進化分析，表明該毒株與仙臺病毒(SeV)的同源性較高，但推導出的氨基酸序列仍存在較大的差異，暫時命名為副粘病毒Tianjn株。進一步的血清學調查結果顯示，動物中心工作人員都含有此

2、病毒的抗體；正常人群(獻血員)中對此病毒的抗體陽性率高達46.7％；患急性呼吸道感染的兒童抗體陽性率為30～37％，說明此病毒與人類關系密切。更重要的是，SeV是嚙齒類動物致死性病原體，而在普通棉耳狨猴呼吸道疾病流行期間，飼養(yǎng)在同一實驗中心的各種實驗用鼠無一例發(fā)病。因而可能是SeV發(fā)生了某些變異而跨越了種屬界限，形成對嚙齒類動物致病性低，對靈長類動物乃至人類致病性高的毒株。目前，我們已經完成了對該株病毒的全基因組測序，全基因組序列的系統(tǒng)

3、進化分析，也說明與SeV同源性較高，證明了該株病毒為SeV的一個新基因型。 為了進一步在分子水平上了解其蛋白結構與功能的關系，探討致病機制，建立簡便、快速、特異的檢測方法，本研究根據全基因組序列，設計合成了三對引物，分三段擴增了副粘病毒Tianjin株的核衣殼蛋白(NP)基因，將擴增片段與質粒pET28a連接，分別構建了原核表達質粒pET28a-NP1、pET28a-NP2和pET28a-NP3。經誘導表達和純化，獲得了重組蛋白

4、NP1、NP2和NP3。以超速離心純化的病毒和純化的重組蛋白分別免疫兔子和小鼠，制備了多克隆抗體(PcAb)；ELISA、dotblot和westernblot方法檢測了重組蛋白NP1、NP2和NP3的免疫反應性；分別以重組蛋白NP1、NP2和NP3為抗原，間接ELISA法檢測了186例下呼吸道感染患兒血清中的IgG、IgM，并與全病毒抗原ELISA法進行了比較。制備了重組蛋白的單克隆抗體(McAb)，對McAb的抗原識別位點、穩(wěn)定性、

5、特異性作了初步分析。 結果表明：(1)重組蛋白NP1、NP2和NP3能與副粘病毒Tianjin株兔多克隆抗血清特異反應，具有天然抗原性，而且抗原性強弱明顯不同，NP3最強，其余依次為NP1和NP2。(2)重組蛋白NP1、NP2和NP3的PcAb與常見呼吸道病原體，如甲、乙型流感病毒，肺炎支原體，甲型流感病毒鼠肺適應株(FM1株)無明顯反應性；NP1和NP3抗血清與副流感病毒I、III型，NDV呈陽性反應，NP2抗血清僅與副流感病

6、毒III型呈陽性反應；而副粘病毒Tianjin株鼠多克隆抗血清與除肺炎支原體以外的上述病原體均有交叉反應。由于重組蛋白比全病毒抗原易獲得、更安全、有利于提高特異性和敏感性，以重組蛋白NP1、NP2和NP3為抗原檢測抗體，比全病毒抗原更有優(yōu)勢。(3)全病毒抗原ELISA法檢測186例患兒血清標本IgG、IgM的陽性率分別是30.65％和19.89％；重組蛋白NP1、NP2和NP3為抗原，IgG陽性率分別為24.19％、22.04％、20.

7、97％；IgM陽性率分別為18.82％、16.67％、15.60％。重組蛋白ELISA法比全病毒抗原ELISA法有特異性更好的趨勢。(4)獲得了一株穩(wěn)定分泌NP2McAb的細胞株G1B9D5。該細胞株培養(yǎng)上清液與NP1和NP3不結合，說明這株McAb的抗原識別位點在NP蛋白aa202-aa324范圍內。McAbG189D5與常見下呼吸道感染病原體沒有交叉反應，特異性好。為進一步研究病毒蛋白結構與功能的關系及致病機制，建立快速、敏感、特異