IgA親和體隨機(jī)組合噬菌體展示文庫的構(gòu)建及體外分子進(jìn)化.pdf

1、IgA是人體一種重要的Ig類型，研究開發(fā)高效特異性檢測和純化IgA的試劑在廣大醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。定向分子進(jìn)化技術(shù)是探索研究生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的重要手段，同時(shí)也是改造、優(yōu)化生物大分子特性的有效方法。DNA重排和噬菌體展示及篩選是體外定向分子進(jìn)化的重要核心技術(shù)。本研究應(yīng)用定向分子進(jìn)化技術(shù)，將特異性結(jié)合IgA的IgA親和體分子隨機(jī)組合，構(gòu)建噬菌體展示文庫，以體外分子進(jìn)化的方法篩選出高結(jié)合活性的具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的新型IgA親和體分

2、子，通過比較IgA親和體單結(jié)構(gòu)分子與重復(fù)結(jié)構(gòu)分子的IgA結(jié)合活性的差異，研究IgA親和體結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，與Ig相互作用的機(jī)q及體外重組進(jìn)化的規(guī)律，為進(jìn)一步應(yīng)用分子進(jìn)化手段改造功能蛋白積累經(jīng)驗(yàn)。本研究分為四個(gè)部分：一、IgA親和體分子的基因合成根據(jù)文獻(xiàn)提供的IgA親和體的氨基酸序列，選擇2個(gè)有代表性的IgA親和體序列A1、A2，設(shè)計(jì)引物，以基因合成的方法制備得到兩個(gè)IgA親和體片段，克隆于pMD-18T載體。經(jīng)過序列分析并與文獻(xiàn)所提供的

3、序列進(jìn)行比對，證明基因合成的IgA親和體序列與文獻(xiàn)中序列完全一致。 二、IgA親和體隨機(jī)組合噬菌體展示文庫的構(gòu)建在IgA親和體A1、A2片段兩端引入KpnI酶切位點(diǎn)，3’端引入3個(gè)隨機(jī)連接肽，經(jīng)DNA重排，隨機(jī)組合形成各種不同長度的片段，插入噬菌粒載體pCANTAB5S的KpnI克隆位點(diǎn)上，展示在噬菌體表面，構(gòu)建噬菌體展示隨機(jī)組合文庫。文庫的庫容量為3.4×107，滴度為L6×1012TU/ml；原代組合文庫中含79％以上的陽性

4、克隆，其中由2個(gè)以上親和體組成的陽性克隆占18％；DNA序列分析顯示原代組合文庫由A1、A2序列隨機(jī)組合而成，各親和體分子之間隨機(jī)連接肽的核苷酸序列也呈隨機(jī)分布。從文庫的庫容量、多樣性和隨機(jī)性各方面來看，該文庫可滿足體外分子進(jìn)化研究的要求。 三、IgA親和體隨機(jī)組合噬菌體展示文庫的分子進(jìn)化以人IgA分子為誘餌對IgA親和體隨機(jī)組合文庫進(jìn)行4輪親和篩選，在人IgA分子導(dǎo)向的進(jìn)化過程中，IgA親和體隨機(jī)組合文庫的展示序列由1個(gè)結(jié)構(gòu)分

5、子和2個(gè)結(jié)構(gòu)分子為主向3個(gè)和4個(gè)結(jié)構(gòu)分子為主轉(zhuǎn)變，最后進(jìn)化為4個(gè)IgA親和體結(jié)構(gòu)分子：A2-A1-A2-A1占絕對優(yōu)勢地位，同時(shí)存在少量3個(gè)結(jié)構(gòu)分子：Al-A1-A1，選取不同大小結(jié)構(gòu)形式的IgA親和體分子制備單克隆噬菌體，通過ELISA檢測它們之間的IgA結(jié)合活性的差異，結(jié)合序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IgA親和體單結(jié)構(gòu)分子和2個(gè)結(jié)構(gòu)分子的結(jié)合活性無明顯差異，而3個(gè)和4個(gè)結(jié)構(gòu)分子的IgA結(jié)合活性顯著提高，明顯高于前者。并且從文庫的篩選結(jié)果可見，

6、最后在文庫中占絕對優(yōu)勢的3個(gè)和4個(gè)結(jié)構(gòu)分子的IgA親和體，是我們在原代文庫的檢測中沒有發(fā)現(xiàn)，而通過分子進(jìn)化的手段得到，證明分子進(jìn)化的方法研究Ig結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)和功能是有效而成功的，同時(shí)也證明文庫的構(gòu)建是成功的。 四、新型IgA親和體代表分子的原核表達(dá)、純化及功能鑒定為了進(jìn)一步證實(shí)IgA親和體的結(jié)構(gòu)對其功能的影響，我們選取了不同大小的4種IgA親和體代表分子，克隆于表達(dá)載體PET32a(+)，原核表達(dá)N端帶His-Tag的融合蛋白

7、，Ni-NTA柱親和層析純化，westernblot及ELISA檢測這些蛋白質(zhì)分子的IgA結(jié)合活性，同時(shí)檢測與IgG、IgM和IgGlFc分子的結(jié)合活性，蛋白質(zhì)活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)新型IgA親和體的IgA結(jié)合活性與單克隆分子噬菌體結(jié)合活性的檢測結(jié)果相符，與IgM沒有結(jié)合作用，但3個(gè)和4個(gè)結(jié)構(gòu)的IgA親和體表現(xiàn)出與IgG和IgGlFc分子有部分結(jié)合作用，進(jìn)一步從蛋白質(zhì)水平為研究Ig結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供新的依據(jù)。 本研究首次將I

8、gA親和體分子隨機(jī)組合構(gòu)建噬菌體展示文庫，應(yīng)用人IgA分子對該組合文庫進(jìn)行體外分子進(jìn)化篩選，獲得了幾種新的IgA親和體重復(fù)結(jié)構(gòu)分子形式，通過比較IgA親和體重復(fù)結(jié)構(gòu)分子與IgA親和體單結(jié)構(gòu)分子的IgA結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)重復(fù)結(jié)構(gòu)分子的結(jié)合活性高于單結(jié)構(gòu)分子，并且研究結(jié)果提示至少需要3個(gè)結(jié)構(gòu)的重復(fù)才能顯著提高結(jié)合活性，從蛋白質(zhì)水平的研究發(fā)現(xiàn)，IgA親和體重復(fù)結(jié)構(gòu)分子改變了原來的單結(jié)構(gòu)分子不與IgG結(jié)合的特性，該研究為Ig結(jié)合分子結(jié)構(gòu)和功能的研究