HIV-1 Tat核心堿性區(qū)隨機突變組合文庫的構(gòu)建及親和篩選.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)歸屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科中慢病毒屬，主要經(jīng)血液、性接觸及母嬰垂直途徑等傳播，可引起獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)，即艾滋病。目前，艾滋病感染已經(jīng)成為全球所面臨的重大公共衛(wèi)生問題。研制有效的HIV疫苗是艾滋病防治的重要手段之一。因此，探索HIV疫苗研究的新策略和尋找新的疫苗靶點對疫苗的成功

2、研發(fā)顯得尤為重要。
　　 HIV-1反式激活蛋白(Trans-activator oftranscription，Tat)是HIV感染早期產(chǎn)生的一種重要調(diào)控蛋白，在HIV-1的復(fù)制、擴散和致病中起重要作用。HIV-1感染靶細(xì)胞后，胞質(zhì)中合成的Tat轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體(transcription initiation complex，TIC)，促進病毒RNA的轉(zhuǎn)錄、延伸和病毒復(fù)制[1]。此外，Ta

3、t還可被感染細(xì)胞通過多種方式分泌到胞外發(fā)揮“病毒毒素”的作用：①通過誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞或B細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮其免疫抑制的作用[2，3，4，5，6]；②通過JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)激活HHV-8的復(fù)制，或通過RGD(Arg-Gly-Asp)與內(nèi)皮細(xì)胞αvβ3和α5β1整合素結(jié)合，與可溶性炎癥因子和血管生成因子協(xié)同促進卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS)的形成[7，8]；③通過影響神經(jīng)細(xì)胞鈣流，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和小膠

4、質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TGF-β、TNF等神經(jīng)毒性物質(zhì)，發(fā)揮神經(jīng)毒作用，促進艾滋病腦病的發(fā)生[9,10,11]。
　　 Tat堿性氨基酸富集區(qū)(49-57aa)是Tat的穿膜和核定位功能基序，是Tat蛋白的主要中和表位之一。其中和抗體可消除Tat分子所特有的穿入其他細(xì)胞發(fā)揮毒性的核心功能[12]。此外，Tat堿性區(qū)序列在各亞型間高度保守，有利于產(chǎn)生交叉反應(yīng)譜更廣的抗體。已有研究表明，構(gòu)建Tat51位、55位定點突變后，堿性區(qū)表位未被破壞，且

5、Tat穿膜活性和胞外活性被大大減弱[13]。因此本研究擬利用噬菌體展示技術(shù)分子進化平臺，對天然Tat堿性區(qū)進行重組改造和篩選，為保證Tat堿性區(qū)表位的完整性，我們保留了Tat核心區(qū)(38-48aa)，構(gòu)建由核心堿性區(qū)突變片段經(jīng)隨機連接肽相互連接的重復(fù)串聯(lián)的噬菌體展示文庫，用含有高中和活性Tat抗體的兔抗血清進行親和篩選，以期獲得一系列堿性區(qū)表位構(gòu)象穩(wěn)定，而生物活性明顯降低的突變體序列，為新型Tat疫苗的研發(fā)做基礎(chǔ)研究。
　　 本

6、研究分以下三部分進行：
　　 一、HIV-1 PET32a-Tat38-61蛋白的表達(dá)及免疫反應(yīng)性鑒定
　　 功能研究表明：Tat蛋白核心區(qū)(38-48aa)可與旁觀未感染細(xì)胞的微管蛋白結(jié)合引發(fā)細(xì)胞凋亡[14]；Tat蛋白堿性區(qū)(49-57aa)介導(dǎo)Tat蛋白穿膜，與Tat細(xì)胞外活性密切相關(guān)[14,15]。結(jié)構(gòu)研究表明[16]：Tat分子為天然非折疊蛋白，屬于無規(guī)則卷曲類型的分子，缺乏穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)，其分子構(gòu)想

7、極不穩(wěn)定，出于快速動態(tài)的變化之中，導(dǎo)致以Tat作為抗原，刺激效果差，高親和力的抗體較少且容易被降解。因此，Tat核心堿性區(qū)重要表位是否能夠得到保留是噬菌體突變文庫親和篩選的基礎(chǔ)。為此，我們首先將Tat的核心堿性區(qū)38-61aa構(gòu)建到原核表達(dá)載體，純化出PET32a-Tat38-61蛋白，并通過含有Tat抗體的陽性血清對其進行免疫反應(yīng)性鑒定。
　　 我們成功構(gòu)建并表達(dá)出PET32a-Tat38-61蛋白，并通過ELISA鑒定其免疫

8、反應(yīng)性，結(jié)果顯示含Tat抗體的血清與PET32a-Tat3861融合蛋白呈特異性反應(yīng)，說明PET32a-Tat38-61蛋白堿性區(qū)重要表位得到保留，為進一步制備針對核心堿性區(qū)的中和抗體以及隨機突變文庫的親和篩選奠定基礎(chǔ)。
　　 二、HIV-1 Tat核心堿性區(qū)隨機突變組合文庫的構(gòu)建
　　 研究表明，堿性區(qū)兩個重要的位點51K和55R定點突變后，對該表位無破壞，且Tat穿膜活性和胞外活性被大大減弱。因此，為了獲得一系列堿性

9、區(qū)表位構(gòu)象穩(wěn)定，而生物活性明顯降低的突變體，我們首先構(gòu)建了針對Tat堿性區(qū)的突變體文庫。通過采用含隨機核苷酸序列的引物， Overlap PCR方法對堿性區(qū)兩個位點51K和55R進行了隨機突變，使之轉(zhuǎn)變成51X和551X。此外，構(gòu)建適合的大容量生物大分子變異體文庫是進行體外分子進化研究的關(guān)鍵。因此，為了擴大堿性區(qū)基因序列中被篩選的范圍，同時在堿性區(qū)61位后引入6個隨機連接肽X6，以期擴大文庫的重組子，并利用隨機連接肽可與堿性區(qū)表位序列之

10、間相互作用，穩(wěn)定展示表位的構(gòu)象。
　　 我們成功構(gòu)建了HIV-1 Tat核心堿性區(qū)隨機突變組合文庫，并且其庫容、多樣性、隨機性均達(dá)到文庫構(gòu)建要求，為后續(xù)用含有高中和活性的抗Tat兔抗血清進行親和篩選奠定了基礎(chǔ)。
　　 三、HIV-1 Tat核心堿性區(qū)隨機突變組合文庫的親和篩選
　　 通過第一部分的鑒定，我們發(fā)現(xiàn)堿性區(qū)肽段可以較好的保留其中和表位，我們用兩種兔抗血清：兔抗PET32a-Tat1-101和兔抗PET3

11、2a-Tat38-101，同時對TCBR隨機突變組合文庫進行親和篩選，以期獲得親和力更強，穿膜活性更低新型免疫原的代表性序列。通過兩種兔抗血清同時對文庫進行兩輪篩選，每輪結(jié)束后，挑取單克隆進行PCR鑒定，并對PCR鑒定過的陽性克隆進行序列分析。
　　 兩種Tat兔抗血清對TCBR文庫兩輪篩選后重組子PCR鑒定結(jié)果顯示：①TCBR文庫中突變片段的插入率由70％上升到90％左右，說明與Tat抗體親和高的突變體片段通過篩選得到有效富集

12、；②包含2個突變片段的重組子在文庫中所占的比例顯著下降，而包含單個突變片段的重組子在文庫中所占的比例由篩選前的55％上升到90％左右。理論上，通過連接肽串聯(lián)重復(fù)多個突變體片段形成的大分子多肽，由于親和力的關(guān)系，抗原表位重復(fù)次數(shù)多具有選擇性優(yōu)勢，容易被進化篩選獲得。但兩輪篩選后突變體片段結(jié)構(gòu)的變化，似乎說明突變體片段的重要突變位點51位、55位的突變情況較大分子多肽對優(yōu)勢抗原表位的富集具有更重要的作用。
　　 兩種Tat兔抗血清對

13、TCBR文庫每輪篩選后，對40個重組子進行序列測定，結(jié)果顯示：①51位堿性氨基酸得到富集，這與理論相符，天然Tat51位為賴氨酸(K)；②51位、55位都出現(xiàn)特征性氨基酸脯氨酸(P)。一項日本實驗研究結(jié)果似乎說明51位突變成P更有利于Tat穿膜[18]，這與本實驗的目的截然相反，但出現(xiàn)了相同的特征性氨基酸，這種聯(lián)系還需要進一步的研究。似乎脯氨酸本身結(jié)構(gòu)更容易穩(wěn)定表位的空間構(gòu)象。③51S-55P可作為一個有意義的候選特征序列，進一步研究。

14、另有一項法國實驗研究表明，將Tat堿性區(qū)的51位賴氨酸(K)定點突變成蘇氨酸(T)，55位精氨酸(R)定點突變成亮氨酸(L)，構(gòu)成突變體“STLA Tat”，其反式激活活性消除，胞外毒性大大降低。根據(jù)氨基酸分類，51位T為極性氨基酸，而篩選得到的特征性氨基酸S與也同為極性氨基酸，55位L為疏水性氨基酸，而篩選得到的特征性氨基酸P與也同為疏水性氨基酸，因此，根據(jù)篩選所得特征性氨基酸結(jié)合已有研究，可將51S-55P作為一個有意義的候選特征序

15、列，做進一步研究。帽綜上所述，我們成功用兩種兔抗血清對TCBR隨機突變文庫進行了兩輪親和篩選，并通過對候選重組子序列測定分析，發(fā)現(xiàn)突變片段的重要位點51位、55位的出現(xiàn)特征性氨基酸，51X為P\S，55X為Y/P，其中，51S-55P可作為一個有意義的可選候選特征序列，進一步研究。
　　 本課題構(gòu)建了pET32a-tat38-61原核表達(dá)質(zhì)粒，純化并鑒定了PET32a-Tat38-61蛋白的免疫反應(yīng)性，為后續(xù)使用Tat兔抗血清對

16、堿性區(qū)突變體文庫篩選奠定了基礎(chǔ)；成功構(gòu)建了HIV-1 Tat核心堿性區(qū)隨機(TCBR)突變組合文庫并通過兩種抗Tat兔抗血清PET32a-Tat1-101和PET32a-Tat38-101對文庫進行了兩輪篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)篩選后重組子突變片段的重要位點51位、55位的出現(xiàn)特征性氨基酸，51X為P\S，55X為Y/P，其中，51S-55P可作為一個有意義的候選特征序列，進一步研究。本研究嘗試應(yīng)用以噬菌體展示技術(shù)為基礎(chǔ)的分子進化手段對HIV-1