HIV-1 耐藥突變對(duì)藥效的影響及兩種新藥的活性研究.pdf

1、在人類與艾滋病30多年抗?fàn)幍臍v程中，抗HIV-1藥物的研發(fā)和應(yīng)用是取得的最大成就之一。1996年首次將不同種類的藥物聯(lián)合應(yīng)用，建立了高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（HAART），能夠把HIV-1復(fù)制抑制到現(xiàn)有方法檢測(cè)不到的水平，大幅度降低了病死率，提高了生存質(zhì)量?；诳共《局委熞约皽p少HIV-1傳播的巨大成功，近幾年國(guó)際上把擴(kuò)大治療和預(yù)防性治療作為艾滋病預(yù)防控制的新型策略，提倡早治療和對(duì)處于感染危險(xiǎn)之下的人暴露前/后預(yù)防用藥。截至2015年6月，

2、全世界已有約1600萬(wàn)人接受過(guò)艾滋病抗病毒治療。因此，與20年前不同的是，目前HIV-1是在普遍存在的藥物壓力下傳播和進(jìn)化的。HIV-1具有高度的變異性和極快的復(fù)制速率，易在藥物選擇壓力下快速產(chǎn)生耐藥性。目前對(duì)所有種類的抗HIV-1藥物均已報(bào)道了耐藥毒株，這將導(dǎo)致藥物失效和治療失敗。因此，研發(fā)對(duì)耐藥病毒株有效的新型抗HIV-1藥物仍然是艾滋病預(yù)防控制的迫切需要。
　　臨床前藥效學(xué)研究是抗HIV-1新藥研發(fā)的基礎(chǔ)，對(duì)耐藥HIV-1毒

3、株抑制活性的評(píng)價(jià)是新藥臨床前藥效學(xué)研究的重要內(nèi)容。美國(guó)FDA抗HIV-1藥物藥效學(xué)研究指南建議，將耐藥性研究作為抗病毒藥物藥效學(xué)研究的重點(diǎn)。相對(duì)于野生型毒株抑制活性的評(píng)價(jià)，對(duì)耐藥毒株的藥效學(xué)研究面臨許多特殊問(wèn)題：（1）我國(guó)既往對(duì)HIV-1耐藥的研究主要是基因型檢測(cè)和分析，尚不具備標(biāo)準(zhǔn)化的表型耐藥檢測(cè)方法以及不了解流行毒株的表型耐藥特征。（2）由于已經(jīng)在臨床上使用的抗HIV-1藥物種類較多，病人往往攜帶多種多個(gè)耐藥突變，不同突變對(duì)藥效的影

4、響不同并難以評(píng)估。（3）常規(guī)使用的評(píng)估指標(biāo)（IC50及其與野生毒株相比提高的倍數(shù)）難以準(zhǔn)確評(píng)估蛋白酶抑制劑（ PIs）和多數(shù)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTIs）耐藥毒株的藥效改變。
　　針對(duì)這些問(wèn)題，本研究首先建立了基于重組病毒的HIV-1表型耐藥檢測(cè)方法，了解我國(guó)主要流行毒株對(duì)常用藥物的表型耐藥情況。然后借此方法評(píng)估了常用抗病毒藥物對(duì)攜帶多種耐藥突變和突變型的HIV-1毒株的抑制活性，提出了一個(gè)新的評(píng)價(jià)參數(shù)。根據(jù)對(duì)HIV-1復(fù)

5、制和抗HIV-1藥物抑制活性的了解，采用所建立的表型耐藥檢測(cè)方法及其他研究方法，利用所建立的評(píng)價(jià)參數(shù)，對(duì)設(shè)計(jì)的兩個(gè)新型抗HIV-1候選藥物（新型蛋白酶抑制劑和針對(duì)Vpu-tetherin相互作用的多肽）進(jìn)行了臨床前抗病毒活性研究，尤其是臨床前耐藥性相關(guān)研究，并初步探討了可能的作用機(jī)制。
　　第一章基于重組病毒的HIV-1表型耐藥檢測(cè)方法的建立及我國(guó)流行毒株表型耐藥特征的研究
　　目前常用的HIV-1耐藥檢測(cè)方法有基因型和表型

6、兩種。基因型耐藥檢測(cè)方法由于快速且價(jià)格低廉，被廣泛開展。表型耐藥檢測(cè)方法由于對(duì)實(shí)驗(yàn)室和技術(shù)要求較高開展較少，但是該方法在耐藥位點(diǎn)鑒定以及新型抗HIV-1藥物的活性研究等方面是必須的。我國(guó)HIV-1毒株流行呈現(xiàn)復(fù)雜的多樣性，目前對(duì)HIV-1毒株基因型耐藥的研究較多，但缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的表型耐藥檢測(cè)方法，對(duì)流行毒株的表型耐藥特征亦不了解。本章的目的是建立一種基于重組病毒的HIV-1表型耐藥檢測(cè)方法，并借此了解我國(guó)主要流行毒株對(duì)常用抗HIV-1藥物

7、的表型耐藥性，從而對(duì)以基因型為基礎(chǔ)的耐藥毒株監(jiān)測(cè)結(jié)果提供補(bǔ)充，為制定藥物使用策略以及臨床合理用藥提供依據(jù)。
　　方法與結(jié)果：（1）采集全國(guó)10個(gè)省市的28例艾滋病患者的血漿標(biāo)本，收集臨床和流行病學(xué)信息。提取純化病毒RNA，巢式RT-PCR擴(kuò)增獲得gag-pol目的片段，包含編碼蛋白酶的全部密碼子（1-99個(gè)）以及逆轉(zhuǎn)錄酶的前312個(gè)密碼子。目的片段測(cè)序后編輯整理，提交至美國(guó)斯坦福大學(xué) HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)，得到基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果，系統(tǒng)

8、進(jìn)化分析得到病毒的基因亞型。病毒的基因型包含 B、CRF01_AE和CRF07_BC，僅2例存在耐藥突變，其余無(wú)任何耐藥相關(guān)突變。（2）以野生型pNL4.3質(zhì)粒為骨架，將來(lái)自病人的gag-pol目的片段克隆至pNL4.3-Δ(SphI-AgeI)上，構(gòu)建重組感染性克隆，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得19株具有穩(wěn)定復(fù)制能力的重組病毒。利用MT2/TZM-bl細(xì)胞的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)重組病毒對(duì)6種目前常用一線抗 HIV-1藥

9、物（AZT/3TC/d4T/ddI/NVP/EFV）的表型耐藥性，重復(fù)3次，獲得114組表型耐藥檢測(cè)數(shù)據(jù)。（3）將基因型和表型耐藥檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析?；蛐团c表型耐藥檢測(cè)結(jié)果的一致率為96.5％。1例接受過(guò)治療的河南患者（HN2009001）攜帶M41L\L210W\T215Y\K103N\K238T耐藥突變，對(duì)6種藥物均表現(xiàn)為耐藥，IC50提高3.92-126.75倍，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。14例未檢出任何耐藥基因突變的患者對(duì)6種藥物均

10、敏感，另有4例未檢出任何耐藥基因突變的病人，對(duì)NVP或EFV的IC50提高3.41-7.84倍。
　　小結(jié)：建立了一種基于重組病毒的HIV-1表型耐藥檢測(cè)和研究方法，多數(shù)表型與基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果一致，可以對(duì)HIV-1的表型耐藥水平進(jìn)行準(zhǔn)確定量評(píng)估，為研究HIV-1的耐藥性以及新型抗HIV-1藥物的臨床前藥效學(xué)奠定了方法基礎(chǔ)。發(fā)現(xiàn)了基因型無(wú)耐藥突變但表型顯示中低度耐藥的病例，提示存在其他導(dǎo)致耐藥的因素，值得深入研究。
　　第二

11、章主要HIV-1耐藥突變及突變型對(duì)藥效的影響及新型評(píng)價(jià)參數(shù)的建立
　　評(píng)估藥物對(duì)HIV-1耐藥毒株的抑制活性，目前使用的指標(biāo)是藥物對(duì)病毒50%抑制活性（IC50）及其相對(duì)于野生毒株提高的倍數(shù)。制定這個(gè)指標(biāo)的前提是假設(shè)耐藥突變僅導(dǎo)致劑量反應(yīng)曲線向右平移，對(duì)曲線的形狀沒(méi)有影響。而實(shí)際上耐藥突變對(duì)藥效可產(chǎn)生全面的影響，不僅IC50提高，劑量反應(yīng)曲線的斜率也會(huì)發(fā)生變化，甚至只有斜率的下降。而目前攜帶各類耐藥突變或突變型的病毒對(duì)各類抗HIV

12、-1藥物藥效的影響還不清楚，使用的指標(biāo)也難以準(zhǔn)確評(píng)估對(duì)各類藥物的表型耐藥性。本章的目的是借助第一章所建立的HIV-1表型耐藥檢測(cè)方法，闡明主要耐藥突變或突變型對(duì)各類抗HIV-1藥物的藥效影響，提出新的考慮了IC50和斜率的評(píng)價(jià)參數(shù)。
　　方法與結(jié)果：（1）以野生型pNL4.3質(zhì)粒為骨架，定點(diǎn)突變構(gòu)建重組感染性克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染獲得8株能穩(wěn)定復(fù)制的攜帶不同耐藥突變的重組病毒。（2）在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定已上市的10種抗HIV-1藥物對(duì)

13、重組病毒的抑制活性，繪制劑量反應(yīng)曲線，重復(fù)3次。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室之前已有的數(shù)據(jù)，共獲得22個(gè)耐藥毒株對(duì)10種抗HIV-1藥物的藥效學(xué)數(shù)據(jù)。（3）概括每種突變毒株對(duì)各種抗HIV-1藥物的藥效學(xué)特征。發(fā)現(xiàn)各類耐藥突變對(duì)不同藥物的藥效學(xué)參數(shù)影響不同，有三種情況：①僅影響IC50，對(duì)斜率無(wú)任何影響。多數(shù)核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NRTIs）耐藥突變屬于這種情況；②對(duì) IC50和斜率均產(chǎn)生影響。例如攜帶K103N\H221Y\Y181C\T215Y突變的重

14、組病毒使得EFV的IC50增加13.36倍，同時(shí)斜率下降為原來(lái)的一半；③僅改變劑量反應(yīng)曲線的斜率而對(duì)IC50無(wú)影響。在非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTIs）和蛋白酶抑制劑（PIs）耐藥毒株中這種情況較為多見。例如，攜帶G48V\I54V突變的重組病毒不影響RTV的IC50但降低斜率，攜帶V82A突變的重組病毒株使SQV的斜率降為野生毒株的0.41，但I(xiàn)C50無(wú)變化。（4）綜合考慮IC50和斜率，并納入臨床前研究可獲得的最大無(wú)毒濃度等數(shù)據(jù)

15、，首次提出新的藥效學(xué)評(píng)價(jià)參數(shù) IIPatoxic，所有藥物的IIPatoxic均與文獻(xiàn)報(bào)道的納入臨床最大血藥濃度的參數(shù)IIPmax具有良好的相關(guān)性（r>0.95， P＜0.001）。
　　小結(jié)：闡明了常見和主要的HIV-1耐藥突變和突變型對(duì)10種抗HIV-1藥物的藥效學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)不同類型的耐藥突變或突變型對(duì)IC50和/或斜率有不同的影響，PIs和NNRTIs耐藥突變對(duì)劑量反應(yīng)曲線的斜率影響最為明顯。首次提出了新的綜合考慮IC50和

16、斜率的可用于臨床前藥效學(xué)研究的評(píng)價(jià)參數(shù)IIPatoxic，可在沒(méi)有藥代學(xué)數(shù)據(jù)時(shí)評(píng)估對(duì)耐藥毒株的抑制活性，為針對(duì)耐藥毒株的臨床前藥效學(xué)研究提供了全面準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)參數(shù)。
　　第三章新型蛋白酶抑制劑DG35的抗HIV-1活性研究
　　我國(guó)目前還沒(méi)有一種在臨床應(yīng)用的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗HIV-1藥物。DG35是我國(guó)自主研發(fā)的以HIV-1蛋白酶為靶標(biāo)的小分子化合物，對(duì)其抗HIV-1活性還不清楚。本章旨在評(píng)估DG35的臨床前抗HIV-1活

17、性，為該藥的后續(xù)研發(fā)提供臨床前藥效學(xué)數(shù)據(jù)。
　　方法與結(jié)果：按照FDA推薦的抗HIV-1藥物臨床前藥效學(xué)研究?jī)?nèi)容，采用之前建立的HIV-1表型耐藥研究方法及構(gòu)建的病毒株，利用所建立的評(píng)價(jià)參數(shù)，采用高通量篩選和評(píng)價(jià)方法，分別從細(xì)胞毒性、對(duì)不同基因背景的病毒株的抑制活性、藥物聯(lián)合配伍效果以及加壓誘導(dǎo)耐藥毒株等幾個(gè)方面，對(duì)DG35進(jìn)行全面的臨床前活性研究，尤其是臨床前耐藥性研究。研究發(fā)現(xiàn)：（1）DG35在本實(shí)驗(yàn)條件下具有肯定的抗HIV-

18、1的活性，且對(duì)野生型參考病毒株（HIV-1NL4.3）的IC50（3.58±0.10nM）低于已在臨床應(yīng)用的IDV（7.19±1.01nM），斜率（3.42±0.58）高于IDV（2.49±0.23）。（2）DG35對(duì)攜帶M46I、I54V、V82A、M46I\N88S和M46I\V82T\I84V耐藥突變病毒株的抑制活性與野生型參考病毒株的抑制活性相當(dāng)（1.02-12.46nM）。與HIV-1NL4.3相比，攜帶蛋白酶抑制劑耐藥突變（

19、G48V\I54V）的毒株對(duì)DG35不僅IC50提高了65.57倍，且劑量反應(yīng)曲線的斜率也發(fā)生變化，其IIPatoxic值亦下降。而DG35對(duì)3株NNRTIs耐藥毒株具有良好的抑制活性。（3） DG35與AZT（NRTI）、EFV（NNRTI）和RTV（PI）均有高度的協(xié)同抗HIV-1作用，協(xié)同指數(shù)分別為592.28nM2%、661.33nM2%和528.72nM2%。（4）體外藥物加壓誘導(dǎo)培養(yǎng)，連續(xù)傳6代，未誘導(dǎo)出DG35的耐藥毒株。

20、
　　小結(jié)：DG35對(duì)實(shí)驗(yàn)室傳代毒株具有較強(qiáng)的抑制活性，對(duì)于常見的PIs耐藥毒株也有一定的抑制活性，但對(duì)攜帶G48V\I54V和G48V\I54V\V82A突變的蛋白酶抑制劑耐藥毒株的活性有所下降，與NNRTIs無(wú)交叉耐藥性。與目前臨床使用的三種抗HIV-1藥物具有高度協(xié)同作用，同時(shí)具有較高的耐藥基因屏障。這些結(jié)果為該藥的后續(xù)研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　第四章以Vpu-tetherin相互作用為靶標(biāo)的抗HIV-1多肽的設(shè)計(jì)和活性研

21、究
　　HIV-1幾乎對(duì)于目前已上市的所有藥物均出現(xiàn)了耐藥性，需要研究針對(duì)新靶點(diǎn)的藥物。Tetherin（THN）是宿主細(xì)胞表面的蛋白，可以將HIV-1粘附到細(xì)胞表面阻斷其出芽復(fù)制，是人體細(xì)胞天然的抗病毒機(jī)制。HIV-1在進(jìn)化過(guò)程中獲得了Vpu，利用細(xì)胞內(nèi)蛋白降解途徑介導(dǎo)tetherin降解，從而對(duì)抗細(xì)胞的天然抗病毒功能。阻斷Vpu對(duì)tetherin的降解作用是有前景的抗HIV-1新靶標(biāo)，然而到目前為止，還沒(méi)有報(bào)道任何一種小分子或

22、者多肽可以阻斷Vpu與tetherin的相互作用。本章的目的是設(shè)計(jì)針對(duì)Vpu-tetherin相互作用的抗HIV-1多肽，進(jìn)行活性驗(yàn)證，探討可能的作用機(jī)制，為新靶點(diǎn)藥物研發(fā)提供新的思路。
　　方法與結(jié)果：（1）檢索野生型參考病毒株HIV-1NL4.3 Vpu的氨基酸序列，以10個(gè)氨基酸為一個(gè)跨度，設(shè)計(jì)、合成了7條可能競(jìng)爭(zhēng)性阻斷Vpu與tetherin結(jié)合的Vpu多肽類似物。同時(shí)從Vpu多肽中隨機(jī)選擇20個(gè)氨基酸合成2條隨機(jī)多肽，作

23、為對(duì)照。（2）利用前期建立的藥效學(xué)研究方法進(jìn)行抑制活性的確證。獲得了3條具有一定抑制活性的多肽，分別命名為CJ128、CJ130和CJ131，IC50分別為4.29±0.05μM、3.75±0.13μM和3.50±0.21μM，而兩條隨機(jī)多肽對(duì)于HIV-1NL4.3未表現(xiàn)出任何抑制活性。（3）Vpu和tetherin在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)，Western blot實(shí)驗(yàn)表明CJ128和CJ130可以恢復(fù)tetherin的表達(dá)水平，多肽可能通過(guò)阻斷

24、Vpu介導(dǎo)的tetherin的降解以抑制HIV-1的復(fù)制。（4）激光掃描共聚焦顯微成像發(fā)現(xiàn)所有活性多肽確實(shí)結(jié)合于細(xì)胞表面，從而可能與存在于細(xì)胞表面的tetherin結(jié)合而發(fā)揮抑制作用，而對(duì)照多肽則無(wú)此現(xiàn)象。
　　小結(jié)：設(shè)計(jì)合成了3條具有潛在抗HIV-1活性的多肽，可抑制Vpu依賴的病毒顆粒的釋放，證實(shí)其定位于細(xì)胞表面，可能與 Vpu競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合存在于細(xì)胞表面的tetherin，對(duì) Vpu介導(dǎo)的tetherin的降解產(chǎn)生一定的阻斷作