HIV-1 Tat蛋白對HCV RNA復(fù)制和蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：人類免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染成全球分布，二者傳播途徑相同，混合感染率極高，且互相影響臨床結(jié)局，但其機(jī)制尚不清楚。HIV Tat蛋白是HIV重要的調(diào)控蛋白，不僅能反式激活HIV的轉(zhuǎn)錄，還能促進(jìn)許多病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建HIV-1 Tat基因真核表達(dá)質(zhì)粒，并研究Tat對HCV RNA復(fù)制和蛋白表達(dá)的影響，為探索HIV-1促進(jìn)HCV致病性的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：以含HIV-1全長基因的

2、質(zhì)粒pNL4-3為模板，PCR擴(kuò)增HIV-1 Tat基因第一外顯子，應(yīng)用基因工程技術(shù)將擴(kuò)增的基因片段插入至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-tat。限制性內(nèi)切酶酶切分析及測序鑒定正確后，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染huh-7細(xì)胞,RT-PCR檢測其基因轉(zhuǎn)錄情況，WesternBlot鑒定其是否能夠表達(dá)相應(yīng)的目的蛋白質(zhì)。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)與HCV復(fù)制子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染huh-7細(xì)胞。48小時(shí)后，提取細(xì)

3、胞總RNA，RT-PCR檢測HCV RNA正鏈5'端非編碼區(qū)序列(UTR)并進(jìn)行半定量分析。提取細(xì)胞總蛋白，Western blot分析HCV核心蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：成功擴(kuò)增了Tat基因，酶切和測序結(jié)果表明重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-tat構(gòu)建正確，RT-PCR和Western blot方法證實(shí)該質(zhì)粒能在huh-7細(xì)胞中有效表達(dá)HIV-1 Tat蛋白質(zhì)。RT-PCR擴(kuò)增HCVRNA正鏈5'UTR的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后攝

4、像并運(yùn)用圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析，經(jīng)t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組和對照組具有顯著性差異(t=15.07)。Western blot檢測HCV核心蛋白結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組HCV RNA核心蛋白表達(dá)水平高于對照組。 結(jié)論：成功構(gòu)建了HIV-1 Tat基因的真核表達(dá)質(zhì)粒載體，并在huh-7中表達(dá)；HIV-1 Tat蛋白能促進(jìn)HCV RNA的復(fù)制和蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探索HIV促進(jìn)HCV致病性的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為HIV陽性的HCV感染者的