HIV-1 Tat、Rev蛋白與DDX3相互作用對(duì)HCV RNA復(fù)制影響的研究.pdf

1、背景與目的：
　　丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)和人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus，HIV)的傳播途徑十分相似，約30％的HIV感染者合并HCV感染。中國(guó)和歐洲靜脈藥癮的HIV感染者中，合并感染HCV甚至可高達(dá)90％[1]。HCV患者合并感染HIV將加速丙型肝炎病程進(jìn)展，同時(shí)降低抗HCV療效。近年較多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)顯示，對(duì)合并感染患者針對(duì)HIV進(jìn)行嚴(yán)格的高效抗逆轉(zhuǎn)

2、錄病毒治療(Highly activeantiretroviral therapy，HAART)不能有效的改善這些情況，同時(shí)HCV病程加速也與CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量下降無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。有研究證實(shí)，HIV合并感染可能導(dǎo)致患者體內(nèi)HCV準(zhǔn)種分布特征改變，但HCV載量及準(zhǔn)種復(fù)雜度與CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量無(wú)關(guān)[2，3]。這些證據(jù)都提示，HIV對(duì)HCV的影響可能存在免疫系統(tǒng)介導(dǎo)之外的其他途徑。有研究證實(shí)HCV、HIV可以共感染同一肝細(xì)胞，進(jìn)而可能導(dǎo)致

3、兩種病毒在同一細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用[4]。HCV、HIV均為RNA病毒，且傳播途徑相似;而DDX3（DEAD-box解旋酶3）在人體細(xì)胞內(nèi)與RNA的復(fù)制過(guò)程關(guān)系密切，已有的研究證實(shí)DDX3可與HCVCore蛋白結(jié)合促進(jìn)HCV復(fù)制[5，6]。同時(shí)也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HIV Tat蛋白可以在淋巴細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)DDX3高表達(dá)[7];另一方面，HIV Rev蛋白可與DDX3結(jié)合在核膜上形成復(fù)合體從而影響胞漿內(nèi)DDX3的水平[8]。
　　本實(shí)驗(yàn)正是基于已

4、有的研究成果，通過(guò)體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞株，并以此細(xì)胞株為基礎(chǔ)，利用HCV復(fù)制質(zhì)粒pCDNA3.1-JFH1構(gòu)建HCV細(xì)胞復(fù)制模型。構(gòu)建Tat、Rev蛋白及DDX3解旋酶相關(guān)表達(dá)載體，通過(guò)HCV細(xì)胞復(fù)制模型，探討Tat、Rev蛋白與DDX3解旋酶相互作用對(duì)HCV復(fù)制的影響。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量qPCR、Western-blot等技術(shù)進(jìn)行分析研究，從而闡明Tat、Rev蛋白與DDX3解旋酶相互作用對(duì)HCV復(fù)制的影響及其機(jī)制。
　

5、　方法:
　　1.查詢NCBI獲得Tat蛋白、Rev蛋白及DDX3的基因表達(dá)序列，并合成相關(guān)基因序列，分別構(gòu)建以熒光蛋白標(biāo)記的HIV Tat表達(dá)載體pcDNA3.1-Tat-Flag-EGF、熒光蛋白標(biāo)記的HIV Rev表達(dá)載體pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry和熒光蛋白標(biāo)記的DDX3表達(dá)載體pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag，相關(guān)表達(dá)載體進(jìn)行PCR鑒定及相關(guān)序列測(cè)定，并分別轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中，進(jìn)行We

6、stern-blot檢測(cè)相關(guān)目的基因的表達(dá)。
　　2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-JFH1重組表達(dá)載體進(jìn)入Huh7細(xì)胞中，設(shè)立為對(duì)照組。將pCDNA3.1-JFH1和pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中，設(shè)立為實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染48h后，提取總RNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)HCV RNA的表達(dá)情況;提取總蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè)DDX3的表達(dá)。
　　3.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-JFH1重組表達(dá)

7、載體進(jìn)入Huh7細(xì)胞中，設(shè)立為對(duì)照組。分別設(shè)立三組實(shí)驗(yàn)組: a、 pCDNA3.1-JFH1、 pcDNA3.1-Tat-Flag-EGF和pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag重組質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中;b、pCDNA3.1-JFH1、pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry和pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag重組質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中; b、 pCDNA3.1-JFH1、 pcDNA3.1-

8、Tat-Flag-EGF、pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry和pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag重組質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，分別提取各組總RNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)HCV RNA的表達(dá)情況;分別提取各組總蛋白Western blot檢測(cè)Tat蛋白、Rev蛋白及DDX3的表達(dá)。
　　結(jié)果與結(jié)論:
　　1.通過(guò)PCR鑒定、序列測(cè)定以及Western-blot檢測(cè)證實(shí)成功構(gòu)建了Tat蛋白

9、、Rev蛋白和DDX3的表達(dá)載體，并能在Huh7細(xì)胞株中表達(dá)。
　　2.通過(guò)qPCR測(cè)定轉(zhuǎn)染48h后比較DDX3對(duì)HCV RNA復(fù)制的影響，證實(shí)DDX3可以促進(jìn)HCV RNA的復(fù)制(P=0.03)。
　　3.通過(guò)qPCR測(cè)定轉(zhuǎn)染48h后比較發(fā)現(xiàn)，Tat+DDX3對(duì)HCV RNA復(fù)制的影響無(wú)顯著差異(t=1.392，p＞0.05);而Rev+DDX3對(duì)HCV RNA復(fù)制的影響有顯著差異(t=8.778，p＜0.01)，表明Re