CVB3 VP1與宿主蛋白MAT1相互作用的研究.pdf

1、目的:
　　進(jìn)一步確證CVB3 VP1與宿主蛋白MAT1存在相互作用，研究VP1與MAT1相互作用對CAK活性的影響，為深入認(rèn)識CVB3的分子致病機(jī)制奠定良好的基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.用MOI=5的CVB3感染HeLa細(xì)胞3h，于相應(yīng)細(xì)胞的蛋白裂解液中，一方面加入anti-MAT1來沉淀VP1蛋白，另一方面加入anti-VP1來沉淀MAT1蛋白，采用免疫共沉淀技術(shù)檢測VP1與MAT1蛋白的表達(dá);
　　2.CV

2、B3感染HeLa細(xì)胞0h、3h、6h、9h及質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞12 h、18 h、24h后，收集各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，用Rhodamine-驢抗小鼠二抗（紅色熒光）與鼠抗VP1單抗的特異結(jié)合來顯示VP1在細(xì)胞中的定位，用Alexa Flour488驢抗山羊二抗（綠色熒光）與山羊抗MAT1的特異性結(jié)合來顯示MAT1在細(xì)胞中的定位，用激光共聚焦顯微鏡觀察VP1與MAT1的亞細(xì)胞共定位現(xiàn)象;
　

3、　3.質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞12h、18h、24h及CVB3感染HeLa細(xì)胞0h、3h、6h、9h后，收集各時(shí)間點(diǎn)胞漿、胞核蛋白，采用Western blotting技術(shù)檢測其中MAT1、CDK7及Cyclin H表達(dá)量的變化:;
　　4.質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞12h、24 h、36h后，提取細(xì)胞蛋白，于其中加入anti-MAT1來沉淀CDK7蛋白，采用免疫共沉淀技術(shù)分析CAK復(fù)合物

4、中CDK7的表達(dá)變化;
　　5.質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞12h、18h、24h及CVB3感染HeLa細(xì)胞0h、3h、6h、9h后，收集各時(shí)間點(diǎn)胞漿、胞核蛋白，采用Western blotting技術(shù)分析RNA PolⅡ CTD與p-RNA PolⅡ CTD的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.在CVB3感染后的HeLa細(xì)胞蛋白中，VP1能被anti-MAT1共沉淀，同時(shí)MAT1能被anti-VP1共沉

5、淀。這表明，病毒感染后的細(xì)胞內(nèi)，VP1與MAT1可以發(fā)生相互作用;
　　2.在CVB3感染組及質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1轉(zhuǎn)染組中均觀察到VP1與MAT1在細(xì)胞漿中存在共定位現(xiàn)象，且病毒感染細(xì)胞后6h及9h，這種現(xiàn)象更為明顯;
　　3.隨著質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1轉(zhuǎn)染及CVB3感染時(shí)間的延長，細(xì)胞總蛋白中MAT1與CDK7表達(dá)量逐漸下調(diào)，Cyclin H表達(dá)無明顯變化趨勢;
　　4.隨著質(zhì)粒pBudCE4.1-

6、VP1轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長，CAK復(fù)合物中CDK7的表達(dá)逐漸地下調(diào);
　　5.隨著質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1轉(zhuǎn)染及病毒感染時(shí)間的延長，胞核蛋白中RNA PolⅡ CTD及p-RNA PolⅡ CTD的表達(dá)量逐漸下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.進(jìn)一步確證了CVB3 VP1與宿主蛋白MAT1存在相互作用;
　　2.VP1與MAT1的相互作用引起CDK7表達(dá)量下調(diào)以及CDK7對RNA PolⅡ CTD磷酸化功能下調(diào)，導(dǎo)致CA