與HSV-1 UL31相互作用的宿主蛋白TMEM140生物學(xué)功能研究.pdf

1、單純皰疹病毒Ⅰ型是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜,感染形式多樣,病理效應(yīng)復(fù)雜的一種雙鏈DNA病毒,與RNA病毒的感染在胞質(zhì)中完成病毒顆粒的裝配形式不同,皰疹病毒的DNA復(fù)制、衣殼體的形成、病毒顆粒的組裝均是在核內(nèi)進(jìn)行。衣殼體將基因組包裹后,穿過(guò)核內(nèi)膜,以出芽的方式進(jìn)入核周隙,衣殼體在穿過(guò)核內(nèi)膜的同時(shí)完成初膜化。病毒蛋白u(yù)131和u134以復(fù)合體的形式促進(jìn)了這一過(guò)程[13]。
　　 鑒于病毒與宿主間相互競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系。在病毒感染過(guò)程中,宿主必然采取某種

2、防御機(jī)制來(lái)進(jìn)行自我保護(hù)。為了了解病毒組裝及出核期間與細(xì)胞分子作用的相關(guān)機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)將UL31基因作為誘餌基因,利用酵母雙雜交體系和人肝組織cDNA預(yù)制文庫(kù),初步篩選出與UL31相互作用的候選蛋白,通過(guò)自激活、β-gal、免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步篩選,我們最后確定TMEM140作為主要研究對(duì)象,探究其在病毒裝配釋放中的功能作用。本課題以分子生物學(xué)、病毒學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)等實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)對(duì)TMEM140的功能特性進(jìn)行了研究。首先,通過(guò)熒光定

3、位實(shí)驗(yàn)觀測(cè)TMEM140-GFP在細(xì)胞中的定位,結(jié)果可見(jiàn)正常狀態(tài)下TMEM140-GFP融合蛋白定位于胞漿中,但當(dāng)感染了HSV1后,部分TMEM140-GFP蛋白向胞核轉(zhuǎn)移。接著,通過(guò)噬斑形成實(shí)驗(yàn)(PFU)觀察到當(dāng)TMEM140高表達(dá)時(shí)可以抑制HSV1病毒的增殖活性。而當(dāng)我們干擾TMEM140在細(xì)胞中的表達(dá)時(shí),抑制作用得以逆轉(zhuǎn)。隨后,通過(guò)透射電鏡分別觀察病毒在高表達(dá)TMEM140的細(xì)胞以及正常細(xì)胞中的分布情況,發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞病變程度較大,

4、病毒顆粒大部分釋放到胞外,而高表達(dá)了TMEM140的實(shí)驗(yàn)組中病毒以組裝好的衣殼形態(tài)大量存在于核內(nèi)。之后,實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了連入U(xiǎn)L31CR1區(qū)片段的標(biāo)簽載體,通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明了TMEM140是與UL31CR1區(qū)結(jié)合,而這一區(qū)域正好是UL34與UL31結(jié)合形成UL31/UL34復(fù)合體的關(guān)鍵區(qū)域。接著,通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)六種皰疹病毒UL31 CR1區(qū)同源蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),確定了6個(gè)保守位點(diǎn),分別將這6個(gè)保守位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變,用免疫共

5、沉淀的方法驗(yàn)證突變點(diǎn)對(duì)TMEM140與UL31的結(jié)合是否有影響,結(jié)果顯示,HSV1第94位氨基酸的改變對(duì)TMEM140與UL31的結(jié)合存在直接的影響。
　　 通過(guò)對(duì)TMEM140蛋白功能的初步分析,基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,初步推測(cè):TMEM140很有可能是作為UL34的競(jìng)爭(zhēng)者與UL31結(jié)合,從而阻斷了UL31/UL34復(fù)合體的形成,進(jìn)而削弱了UL31/UL34幫助病毒顆粒出核形成成熟病毒釋放的作用,最終對(duì)病毒的裝配釋放起到抑制作用。以