不同亞類小鼠IgG對SpA和SpG單結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的隨機(jī)組合噬菌體文庫的體外進(jìn)化研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌蛋白 A(staphylococcal protein A,SpA)和鏈球菌蛋白G(streptococcal protein G,SpG)是研究最多的細(xì)菌免疫球蛋白結(jié)合蛋白(Immunoglobulin(Ig)-binding proteins,IBPs),其中SpA的分子量大約57KDa,含有5個(gè)具有Ig結(jié)合功能且重復(fù)串聯(lián)的結(jié)構(gòu)域,為E、D、A、B、C。SpG分子量為65 kDa,包含3個(gè)具有Ig結(jié)合功能且重復(fù)串聯(lián)的結(jié)

2、構(gòu)域,為B1、B2、B3。SpA和SpG均可結(jié)合于哺乳動(dòng)物IgG-Fc的CH2γ和CH3γ間的分界且與IgG-Fc的結(jié)合強(qiáng),已被廣泛用于制備、純化與檢測抗體、免疫沉淀試驗(yàn)和免疫吸附治療,在科研、檢測和治療方面成為了重要的工具。為進(jìn)一步研究SpA和SpG與Fc的結(jié)合特性,在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)對細(xì)菌免疫球蛋白結(jié)合分子SpA、SpG、PpL中單結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的隨機(jī)組合文庫進(jìn)行體外進(jìn)化親和篩選,獲得了 A-L(PpL的B3結(jié)構(gòu)域)、A-G2、

3、LD3、LD5、E-B-B3以及 D-A-B3-B3等多種新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子(Novel evolved Ig-binding molecules,NEIBMs)基礎(chǔ)上,本研究采用不同亞類小鼠IgG抗體IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3對以SpA和SpG單結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的隨機(jī)組合噬菌體展示文庫進(jìn)行體外進(jìn)化親和篩選,以期獲得與小鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3具有不同結(jié)合活性的新型組合分子,為進(jìn)一步研究不同亞類小

4、鼠IgG Fc段構(gòu)像及與SpA或SpG的結(jié)合特點(diǎn)提供了新的參考分子。
　　本研究共分以下三個(gè)部分:
　　第一部分不同亞類小鼠IgG對以SpA和SpG單結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的隨機(jī)組合噬菌體文庫的親和篩選
　　采用小鼠IgG抗體IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3為誘餌分子對以SpA和SpG單結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的隨機(jī)組合噬菌體文庫進(jìn)化體外進(jìn)化篩選,通過―吸附‖-―洗脫‖-―擴(kuò)增‖的重復(fù)過程,經(jīng)幾輪篩選,以不同亞類小鼠IgG為誘餌分子的

5、文庫中摻入的空噬菌體及插入單個(gè)結(jié)構(gòu)域完全消失且全部是插入兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,提示文庫均進(jìn)化完全。對以小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3為誘餌分子對噬菌體文庫進(jìn)行親和篩選的鑒定平板中,從第5、4、、5和5代分別都隨機(jī)挑選10個(gè)陽性單克隆進(jìn)行序列測定。
　　序列測定結(jié)果經(jīng)DNAssist軟件進(jìn)行分析,得知以小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3為誘餌分子篩選到的優(yōu)勢組合分子分別是:DD、DD、AC和DC。
　　第二部

6、分噬菌體ELISA方法鑒定篩選到的優(yōu)勢組合分子的結(jié)合能力
　　采用噬菌體ELISA的方法進(jìn)一步的驗(yàn)證篩選獲得的代表性組合序列DD、AC和DC與不同亞類小鼠IgG的結(jié)合活性。
　　結(jié)果表明:以小鼠的某種抗體為誘餌分子對混合的噬菌體文庫篩選出的優(yōu)勢組合分子,在噬菌體水平上與該小鼠抗體的結(jié)合能力相對其他組合分子較強(qiáng):即以小鼠IgG1為誘餌分子篩選到的組合分子為DD,其在噬菌體水平上與小鼠IgG1的結(jié)合活性相較于AC和DC較強(qiáng);以小

7、鼠IgG2a為誘餌分子篩選到的組合分子為DD,其在噬菌體水平上與小鼠IgG2a的結(jié)合活性相較于AC和DC較強(qiáng);以小鼠IgG2b為誘餌分子篩選到的組合分子為AC,其在噬菌體水平上與小鼠IgG2b的結(jié)合活性相較于DD和DC較強(qiáng);以小鼠IgG3為誘餌分子篩選到的組合分子為DC,其在噬菌體水平上與小鼠IgG3的結(jié)合活性相較于DD和AC較強(qiáng);這種結(jié)果和我們的親和篩選是相一致的。
　　第三部分噬菌體展示代表性組合分子的原核表達(dá)、純化及功能鑒定

8、
　　為了進(jìn)一步檢測3種組合分子結(jié)合特性,我們將這3種組合分子DD、AC和DC分別克隆于原核表達(dá)載體pET32a(+)中,構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET32a-DDC、pET32a-AC和pET32a-DC、。將這3種構(gòu)建好重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),超聲破菌,離心制備細(xì)胞液及包涵體,SDS-PAGE結(jié)果分析顯示,細(xì)菌胞液中出現(xiàn)了分子量大小為35 Kda的表達(dá)蛋白,與目的蛋白理論分子量大小是相一致。然后,大量

9、誘導(dǎo)表達(dá)這3種蛋白,用Ni-NTA柱親和層析純化,獲得純度大于90％的3種蛋白,分別命名為DD、AC和DC。將這3種經(jīng)HRP標(biāo)記后分別命名為HRP-DD、HRP-AC和HRP-DC,采用ELISA的方法比較這三種蛋白和陽性對照HRP-SpA與不同亞類小鼠IgG和人IgG的結(jié)合活性。
　　ELISA結(jié)果顯示:(1)人IgG,小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3與HRP-SPA結(jié)合活性都很強(qiáng);(2)人IgG,小鼠IgG1、I

10、gG2a、IgG2b和IgG3與HRP-SpA、HRP-DD、HRP-AC、 HRP-DC的結(jié)合活性強(qiáng)弱具有一致性,且均為:人IgG>IgG3>IgG2a>IgG2b>IgG1。
　　總結(jié):
　　1、本研究成功采用小鼠IgG抗體IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3對SpA、SpG單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合噬菌體展示文庫進(jìn)行體外分子進(jìn)化篩選,獲得了3種新的天然分子中不存在的且分別與小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3具有

11、結(jié)合優(yōu)勢的組合分子: DD、DD、AC和DC.
　　2、在噬菌體水平上進(jìn)一步驗(yàn)證了篩選結(jié)果。
　　3、原核表達(dá)融合蛋白DD、AC和DC,HRP標(biāo)記后與不同亞類小鼠IgG及人IgG結(jié)合能力弱于天然HRP-SpA分子,但是其與不同亞類小鼠IgG及人IgG結(jié)合活性的強(qiáng)弱均具有一致性,即:人IgG>IgG3>IgG2a>IgG2b>IgG1。
　　本研究成功的采用不同亞類小鼠IgG抗體IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3