噬菌體對(duì)小鼠泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌膿毒癥療效的研究.pdf

1、目前鮑曼不動(dòng)桿菌已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要致病菌之一，而且在燒傷病房尤其突出，筆者所在科室燒傷重癥病房2011年1月至2014年12月收治的162例燒傷患者的血液標(biāo)本共計(jì)1658份，病原菌檢出339株，前三位分別是鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii ABA)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SAU)以及銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PAE)。國(guó)內(nèi)大部分文獻(xiàn)報(bào)

2、道鮑曼不動(dòng)桿菌的檢出率僅低于銅綠假單胞菌，位居第二。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，1991年紐約首次暴發(fā)鮑曼不動(dòng)桿菌感染以來，世界各地對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥現(xiàn)象的報(bào)道層出不窮，尤其是對(duì)碳青霉烯類抗菌素耐藥現(xiàn)象的增多，使成功治療鮑曼不動(dòng)桿菌所致感染變得困難。加上開發(fā)新的抗菌素周期長(zhǎng)，耗費(fèi)資金巨大以及細(xì)菌耐藥變異迅速，亟需尋找新的治療方案。噬菌體是一種以細(xì)菌為宿主的病毒，噬菌體制劑經(jīng)過臨床驗(yàn)證能夠有效治療細(xì)菌感染。1958年，我國(guó)細(xì)菌學(xué)教授余賀，就利用噬菌體

3、成功治療了銅綠假單胞菌所致燒傷患者感染。過去幾十年里，大量抗生素得以研發(fā)并廣泛應(yīng)用于臨床，相應(yīng)限制了噬菌體的使用。近年來，隨著細(xì)菌耐藥情況越來越嚴(yán)重，歐美國(guó)家開始重新重視噬菌體在細(xì)菌感染治療中的作用，國(guó)內(nèi)一些單位也開始進(jìn)行相關(guān)研究。筆者單位在篩選分離噬菌體并建立噬菌體庫方面進(jìn)行探索。
　　目的：
　　本研究通過篩選泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌裂解性噬菌體，建立泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌所致小鼠膿毒癥模型，并使用所篩選到的噬菌體進(jìn)行相關(guān)的動(dòng)物實(shí)

4、驗(yàn)。通過分析噬菌體治療后小鼠存活情況、對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響及其細(xì)菌清除情況，觀察和研究噬菌體對(duì)來源于燒傷患者的泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌所致小鼠膿毒癥的治療效果。
　　方法：
　　(1)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌裂解性噬菌體的分離與保存
　　使用混合宿主菌擴(kuò)增噬菌體的方法，以泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌為宿主菌，在筆者所在醫(yī)院未經(jīng)處理的污水池中取污水篩選得到泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌裂解性噬菌體8株，并測(cè)定各株裂解性噬菌體的裂解譜，選取其裂解譜最寬、裂解

5、效果最好的裂解性噬菌體備用，作為抗菌劑進(jìn)行后續(xù)動(dòng)物治療實(shí)驗(yàn)。
　　(2)小鼠泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌膿毒癥模型的建立
　　將48只8～12周齡雄性健康BALB/c小鼠，隨機(jī)分為4組，每組12只，記為A，B，C，D四組。分別向A，B，C，D，四組小鼠腹腔注射泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌5×108CFU/mL，2.5×108CFU/mL，1×108CFU/mL，5×107CFU/mL這四個(gè)濃度的菌液各1mL。注射成功后，將各組小鼠按正常飼養(yǎng)，密

6、切觀察各組小鼠生命體征，死亡小鼠數(shù)量，腹腔灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，血培養(yǎng)結(jié)果。
　　(3)噬菌體對(duì)小鼠泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌膿毒癥的治療效果
　　Ⅰ.將60只BALB/c小鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、膿毒癥對(duì)照組、抗生素治療組、噬菌體治療組、噬菌體對(duì)照組，每組12只。空白對(duì)照組小鼠腹腔（注射部位下同）注射生理鹽水1mL;膿毒癥對(duì)照組、抗生素治療組、噬菌體治療組小鼠注射5×107CFU/mL鮑曼不動(dòng)桿菌1mL建立膿毒癥模型。2h

7、后，膿毒癥對(duì)照組注射生理鹽水1mL，抗生素治療組注射1mg/mL亞胺培南/西司他丁1mL，噬菌體治療組腹腔注射1×108PFU/mL噬菌體1mL;噬菌體對(duì)照組注射1×108PFU/mL噬菌體1mL。每組均連續(xù)注射7d，每天觀察記錄小鼠存活情況。
　　Ⅱ.另取60只BALB/c小鼠，同Ⅰ分組處理。實(shí)驗(yàn)第2、4、6天當(dāng)天注射前，每組選1～3只存活小鼠，每只鼠取眶靜脈血20μL檢查白細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)第2天取血小鼠另取1mL眶靜脈血行細(xì)菌培

8、養(yǎng);另取小鼠肺、肝、腎、脾組織，勻漿、稀釋后行菌落計(jì)數(shù)后計(jì)算細(xì)菌含量。對(duì)數(shù)據(jù)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)及Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　(1)以22株泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌為宿主菌，筆者所在醫(yī)院未經(jīng)消毒處理的污水池為噬菌體來源，共篩選得到8株裂解性噬菌體，通過噬菌體裂解譜測(cè)定，其中Bp201404072號(hào)噬菌體裂解譜59％，高于其他7株噬菌體，故選取該株噬菌體作為抗菌劑，用于后

9、續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，4℃冰箱凍存。
　　(2)各組小鼠注射不同濃度鮑曼不動(dòng)桿菌后，四組小鼠均出現(xiàn)典型的膿毒癥相關(guān)癥狀，其中A，B兩組小鼠較C，D兩組急性感染癥狀明顯。實(shí)驗(yàn)第7天，A，B，C，D四組小鼠均死亡。其中A組小鼠實(shí)驗(yàn)第3天均死亡，B組小鼠于實(shí)驗(yàn)第4天全部死亡，C組小鼠于實(shí)驗(yàn)第5天全部死亡，D組小鼠于實(shí)驗(yàn)第7天均死亡（其中一只小鼠存活時(shí)予以處死，取眶靜脈血做細(xì)菌培養(yǎng)）。各組小鼠生存天數(shù)采用log-rank test，與D組相比，其他

10、各組存活天數(shù)較短（P=0.002，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。A，B，C，D四組小鼠腹腔灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)可見明顯菌落形成。D組存活小鼠眶靜脈血培養(yǎng)結(jié)果提示陽性，細(xì)菌學(xué)鑒定結(jié)果提示為鮑曼不動(dòng)桿菌。對(duì)比各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，D組注射菌液濃度(5×107CFU/mL)符合后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求。故后續(xù)小鼠泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌膿毒癥模型菌液濃度定為5×107CFU/mL。
　　(3)Ⅰ.實(shí)驗(yàn)第7天，空白對(duì)照組、膿毒癥對(duì)照組、抗生素治療組、噬菌體治療組、噬菌體對(duì)照組小鼠

11、存活數(shù)分別為12、0、8、10、12只。與膿毒癥對(duì)照組比較，其余4組小鼠存活比均明顯升高（Z值為55.635～106.593，P值均小于0.05）;噬菌體治療組小鼠存活率稍高于抗生素治療組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.797，P＞0.05)。
　?、?膿毒癥對(duì)照組、抗生素治療組、噬菌體治療組小鼠實(shí)驗(yàn)第2天分別死亡3、2、1只，實(shí)驗(yàn)第4天分別死亡10、7、6只，實(shí)驗(yàn)第6天分別死亡12、11、8只。實(shí)驗(yàn)第2天，空白對(duì)照組、噬菌體治療組

12、、噬菌體對(duì)照組小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)相近，3組均明顯低于膿毒癥對(duì)照組的(P＜0.05)，且后2組明顯低于抗生素治療組的（P值均小于0.05）。實(shí)驗(yàn)第4天，抗生素治療組、噬菌體治療組、噬菌體對(duì)照組小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)相近，明顯低于空白對(duì)照組(P＜0.05)，前4組白細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯低于膿毒癥對(duì)照組(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)第6天，空白對(duì)照組、抗生素治療組、噬菌體治療組、噬菌體對(duì)照組小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=4.128，P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)第2天，

13、空白對(duì)照組、膿毒癥對(duì)照組、抗生素治療組、噬菌體治療組、噬菌體對(duì)照組分別有0、12、7、2、0只小鼠血細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果為陽性?？瞻讓?duì)照組、噬菌體治療組、噬菌體對(duì)照組小鼠血細(xì)菌培養(yǎng)陽性比顯著低于膿毒癥對(duì)照組（x2值為-30.0～30.0，P值均小于0.01）?？股刂委熃M小鼠血細(xì)菌培養(yǎng)陽性比顯著高于空白對(duì)照組和噬菌體對(duì)照組（x2值分別為17.5、-17.5，P值均小于0.05）。實(shí)驗(yàn)第2天，除噬菌體治療組小鼠腎組織外，空白對(duì)照組、噬菌體治療組、

14、噬菌體對(duì)照組小鼠各臟器組織細(xì)菌含量均為0，均顯著低于膿毒癥對(duì)照組（x2值為-9.0～9.0，P值均小于0.01）;抗生素治療組小鼠腎組織細(xì)菌含量顯著高于空白對(duì)照組和噬菌體對(duì)照組（x2值分別為-7.5、7.5，P值均小于0.05）。
　　結(jié)論：
　　通過篩選得到的泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌裂解性噬菌體作為抗菌劑，用于噬菌體治療小鼠泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌所致膿毒癥，能明顯提高膿毒癥小鼠生存率，控制炎癥反應(yīng)，證明了泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體運(yùn)用