噬菌體展示技術(shù)對(duì)免疫球蛋白結(jié)合分子結(jié)構(gòu)與功能的系列研究.pdf

1、第一部分，目的：構(gòu)建由噬菌體展示的免疫球蛋白結(jié)合蛋白ProteinA的定點(diǎn)隨機(jī)突變體組合文庫，并應(yīng)用各種類型免疫球蛋白對(duì)該組合文庫進(jìn)行體外親和篩選，以獲得各種具有不同結(jié)合特性的新的Ig結(jié)合分子結(jié)構(gòu)，同時(shí)也為研究Ig與Ig結(jié)合分子相互作用的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。 方法：應(yīng)用OverlapPCR的方法制備ProteinA的Z結(jié)構(gòu)域(ProteinA-Z)，克隆于pMD-18T載體構(gòu)建PA-Z/pMD-18T重組質(zhì)粒。并應(yīng)用含隨機(jī)核苷酸序

2、列(NNS)的引物，通過OverlapPCR方法制備對(duì)ProteinA-Z的第10、13、27、28、31和32位氨基酸進(jìn)行隨機(jī)突變的定點(diǎn)隨機(jī)突變體片段。在突變體片段的3’端引入3個(gè)氨基酸大小(NNS)的隨機(jī)連接肽，將片段隨機(jī)連接，克隆于噬菌粒展示載體pCANTAB5S，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl后輔助噬菌體M13K07拯救，構(gòu)建由噬菌體展示的ProteinA-Z定點(diǎn)隨機(jī)突變體組合文庫。測定庫容量、滴度，挑取單克隆進(jìn)行序列測定，評(píng)價(jià)文庫的隨機(jī)性

3、。應(yīng)用人IgG、IgA分別對(duì)該噬菌體文庫進(jìn)行4輪體外親和篩選，結(jié)合實(shí)驗(yàn)監(jiān)測篩選親和力的變化，PCR法監(jiān)測篩選過程中各不同數(shù)目結(jié)構(gòu)域組成的變化。 結(jié)果：獲得了庫容量為2.4×107，滴度為1.4×1012TU/ml的噬菌體展示ProteinA-Z定點(diǎn)隨機(jī)突變體組合文庫，經(jīng)測定該庫在一級(jí)結(jié)構(gòu)上具有較好的隨機(jī)性和多樣性。但在IgG、IgA親和篩選過程中未獲得陽性結(jié)合分子。 結(jié)論：對(duì)ProteinA-Z的6位氨基酸隨機(jī)突變并引入

4、3個(gè)氨基酸大小隨機(jī)連接肽，理論上包含的分子數(shù)目達(dá)到1010以上，為獲得各種不同的免疫球蛋白結(jié)合分子，需要更大容量的噬菌體展示文庫。但本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)是對(duì)獲得各種新型高特異性高親和力Ig結(jié)合分子的一次科學(xué)的探索，同時(shí)也為噬菌體展示技術(shù)在免疫球蛋白結(jié)合分子進(jìn)化研究中的應(yīng)用提供了新的可借鑒方法。 第二部分，目的：應(yīng)用噬菌體展示體外分子進(jìn)化的方法，以結(jié)合抗原與不結(jié)合抗原的抗體對(duì)同一噬菌體展示免疫球蛋白結(jié)合分子組合文庫進(jìn)化篩選，觀察所獲得的

5、敏感性代表序列是否不同。進(jìn)一步檢測這些序列與抗體結(jié)合抗原及不結(jié)合抗原時(shí)的結(jié)合活性，證明抗原結(jié)合是否能夠引起抗體效應(yīng)子(Fc段)構(gòu)象的改變，以及該構(gòu)象改變對(duì)其結(jié)合特性的影響，從而闡明抗原結(jié)合對(duì)其效應(yīng)功能的影響機(jī)制。 方法：選用包含效應(yīng)子結(jié)合蛋白ProteinA的D(PA-D)、A(PA-A)結(jié)構(gòu)域及ProteinG的B2結(jié)構(gòu)域(PG)的單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫，分別應(yīng)用人IgG與人抗HCV陽性血清包被抗原對(duì)該組合文庫進(jìn)化篩選，比較分析

6、各進(jìn)化文庫代表性序列的異同性。再以小鼠3種單克隆抗體2H10、8B9、2O8以及分別結(jié)合HCVCT抗原后對(duì)該文庫進(jìn)化篩選，序列分析后選取代表性陽性單克隆，用ELISA法分別測定與3種抗體結(jié)合抗原及不結(jié)合抗原狀態(tài)下的結(jié)合活性，判斷不同代表序列與不同狀態(tài)抗體的結(jié)合是否存在傾向性的差別。 結(jié)果：在人IgG導(dǎo)向的篩選過程中，文庫的展示序列全部進(jìn)化為一天然細(xì)菌蛋白中不存在的新的結(jié)構(gòu)形式PA-A-PG；而在人抗HCV陽性血清包被抗原的進(jìn)化文

7、庫中90％展示為PA-A-PA-A、PA-A-PA-D和PA-D-PA-A結(jié)構(gòu)，二者的代表性序列有顯著差異。小鼠2O8抗體的篩選也得到了結(jié)合抗原前后不同的優(yōu)勢進(jìn)化序列，即未結(jié)合抗原的2O8抗體進(jìn)化文庫的非天然結(jié)構(gòu)形式PA-A-PG-PL、PA-A-PG-PG、PA-A-PA-A-PG(占80％)和結(jié)合抗原的2O8進(jìn)化文庫的結(jié)構(gòu)形式PA-A-PA-A、PA-A-PA-D-PA-A(占70％)，測定這些不同序列分別與小鼠結(jié)合抗原及不結(jié)合抗原