免疫球蛋白 ppt課件

1、免疫球蛋白,抗體（antibody，Ab)：B細(xì)胞在Ag刺激下，產(chǎn)生能與相應(yīng)Ag發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）：具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白。Ab和Ig具有不同之處 Ab是Ig，但I(xiàn)g不一定是Ab免疫球蛋白可分為分泌型(secreted Ig，SIg)和膜型(membrane Ig，mIg)。 Ab介導(dǎo)的免疫稱為體液免疫。,Emil von Behring

2、(1845-1917),1901, antitoxinsantibody,是介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子，是B細(xì)胞接受抗原刺激后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的球蛋白。,,一、免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),四條肽鏈結(jié)構(gòu)Ig的基本結(jié)構(gòu)是四條肽鏈的對稱結(jié)構(gòu) 2H+2L=Ig單體,,一、免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),重鏈：免疫球蛋白重鏈分子量約為50～75kDa，由450～550個氨基酸殘基組成，并結(jié)合有不同糖基，因此免疫球蛋白屬糖蛋白。H鏈：µ、

3、γ、α、δ、ε IgM IgG IgA IgD IgE,不同類的免疫球蛋白，其鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置、連接寡糖的數(shù)量、結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及鉸鏈區(qū)的長度等均不完全相同,同一類免疫球蛋白，其鉸鏈區(qū)氨基酸的組成和重鏈二硫鍵的數(shù)目等也不同，據(jù)此又可將同類免疫球蛋白分為不同亞類(subclass)。,,一、免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),輕鏈：免疫球蛋白輕鏈分子量約為25kDa，由214個氨基酸殘基組成。根據(jù)輕鏈結(jié)構(gòu)和抗原性

4、的不同分為κ(kappa)鏈和λ(lambda)鏈，免疫球蛋白因此分為兩型(type)，即κ型和λ型。各類免疫球蛋白輕鏈均有κ型和λ型，兩型輕鏈的功能無差異。正常人血清免疫球蛋白的κ型: λ型約為2:1，在小鼠則為20:1。,,一、免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),可變區(qū)和恒定區(qū)可變區(qū)（Variable Region，V區(qū)）：位于Ig分子N端，占輕鏈1/2和重鏈1/4或1/5；不同抗體其IgV區(qū)氨基酸組成和排列有較大差異，并決定抗體與抗原結(jié)合的

5、特異性；,H:30-35;50-63;95-102; L:23-34, 50-60,89-97;,,一、免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),可變區(qū)和恒定區(qū)高變區(qū)（hypervariable region, HVR），或稱互補(bǔ)性決定區(qū)（complementarity-determining region，CDR）: VH和VL可變區(qū)內(nèi)各有3個區(qū)域的氨基酸組成和排列順序變化特別大，共同組成一個與抗原決定基互補(bǔ)的表面，即抗

6、原結(jié)合部位。用HVR1-3或CDR1-3表示。一般CDR3的變化程度最高。CDR決定了抗體的特異性。 獨(dú)特型決定簇：與特異性抗原結(jié)合的部位。骨架區(qū)（Framework region,FR）,,一、免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),可變區(qū)和恒定區(qū)恒定區(qū)（Constant Region，C區(qū)）:位于Ig 分子的C端，占輕鏈1/2和重鏈3/4（IgA、IgD）或4/5（IgM、IgE）。在同一種屬中，同一類重鏈和同一類輕鏈C區(qū)氨基酸的組成或排

7、列比較恒定。介導(dǎo)Ig多種生物學(xué)功能。重鏈和輕鏈的C區(qū)分別稱為CH和CL，不同型免疫球蛋白的CL長度基本一致，但不同類免疫球蛋白的CH長度不盡相同，可從CH1～CH3或CH1～CH4。,,一、免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),鉸鏈區(qū) CH1和CH2之間, 由30個氨基酸組成的富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)稱為鉸鏈區(qū)。 功能：（1）利于Ig CDR與Ag決定簇吻合；（2）與Ag結(jié)合后，“T”轉(zhuǎn)變?yōu)椤癥

8、”型，補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)暴露．,,二、免疫球蛋白的功能區(qū),結(jié)構(gòu)域：Ig的多肽鏈分子中約110個氨基酸可折疊成由鏈內(nèi)二硫鍵連接的具有特定功能的球形結(jié)構(gòu)。稱為免疫球蛋白的功能區(qū)或結(jié)構(gòu)域（domain）.,,＊ VL和VH: 抗原結(jié)合部位＊ CL和CH1:同種異型的遺傳標(biāo)記所在處＊ CH2和CH3： ① IgG的CH2和IgM的CH3: 補(bǔ)體C1q結(jié)合點(diǎn)； ② 母體的IgG借助CH2通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)＊ CH3、CH4:

9、與細(xì)胞Fc受體結(jié)合的部位 IgG的CH3可結(jié)合細(xì)胞表面的FcR，IgE的CH2和CH3可與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的IgE Fc受體結(jié)合。,二、免疫球蛋白的功能區(qū),二、免疫球蛋白的功能區(qū),Ig超家族（IgSF）：與Ig結(jié)構(gòu)相似、遺傳基因同源的蛋白分子，它們主要以膜蛋白的形式存在于細(xì)胞表面。編碼IgSF的基因稱為Ig基因超家族。IgSF以單體、二聚體或多聚體的形式分布于各類細(xì)胞表面，參與細(xì)胞間相互識別和相互作用，可介導(dǎo)細(xì)胞間的黏

10、附和信號傳導(dǎo)，參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)以及淋巴細(xì)胞歸巢。,,三、免疫球蛋白的其他成分,J鏈：由漿細(xì)胞合成、富含Cys的多肽鏈，連接Ig 單體形成多聚體，如IgA二聚體和IgM五聚體的形成。分泌片（SP）：由粘膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生的含糖肽鏈，為分泌型IgA的輔助成分，可以非共價形式結(jié)合到IgA二聚體上，并一起分泌到粘膜表面。作用機(jī)理：保護(hù)鉸鏈區(qū)的酶解，介導(dǎo)二聚體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。,SIgA參與黏膜局部免疫,,四、免疫球蛋白的酶解片段,木瓜蛋白酶

11、 2 Fab 結(jié)合Ag 1 Fc 可結(jié)晶，保留Ag性及相應(yīng)功能區(qū)的功能胃蛋白酶: 1 F(Ab’)2 結(jié)合Ag，雙價 pFc’ 無活性碎片意義：免疫球蛋白酶解片段的研究不僅對闡明免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和生物活性十分重要，而且對生物制品的應(yīng)用也有重要意義。如白喉抗毒素、破傷風(fēng)抗毒素經(jīng)胃蛋白酶酶解后精制提純的制品，因去掉Fc段而減少超敏反應(yīng)的發(fā)生。,,四、免疫球蛋白的抗原性或異質(zhì)性,免

12、疫球蛋白異質(zhì)性表現(xiàn)為：不同抗原表位刺激所產(chǎn)生的抗體分子，其結(jié)合抗原的特異性不同；同一抗原表位刺激所產(chǎn)生的抗體分子，其結(jié)合抗原的特異性相同；但恒定區(qū)不同?？贵w可變區(qū)的異質(zhì)性抗體恒定區(qū)的異質(zhì)性：類、亞類、型、亞型外源因素引起的異質(zhì)性——Ig的多樣性內(nèi)源因素引起的異質(zhì)性——Ig的血清型 同種型、同種異型、獨(dú)特型,免疫球蛋白的抗原性,同種型(isotype)：是同一種屬所有個體的免疫球蛋白分子所共有的抗原特異性。同種異型

13、(allotype)：是同一種屬的不同個體間的免疫球蛋白分子所具有的不同的抗原特異性。獨(dú)特型：同一個體內(nèi)的免疫球蛋白分子可變區(qū)的抗原特異性各不相同，其超變區(qū)各自具備獨(dú)特的抗原表位結(jié)構(gòu)，稱為抗體的獨(dú)特型(idiotype, Id)。,四、免疫球蛋白的抗原性,抗獨(dú)特型抗體：獨(dú)特型可刺激異種、同種異體以及自體產(chǎn)生的抗體為抗獨(dú)特型抗體（Anti-idiotype antibody,AId）意義：獨(dú)特型-抗獨(dú)特型網(wǎng)絡(luò)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的主要方式之

14、一。,五、各類Ig的特點(diǎn),＊單體結(jié)構(gòu)＊ 含量高，占血清Ig總量的75-80％，其中IgG1含量最多＊ 半衰期約最長：20-23天，再次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體，其親和力高，分布廣＊ 中和毒素、調(diào)理吞噬、激活補(bǔ)體，是抗感染的主要抗體＊ 唯一能通過胎盤的Ig（ IgG1~3）——新生兒抗感染免疫＊ 能與葡萄球菌胞壁上的A蛋白(SPA)結(jié)合——純化抗體、免疫診斷,IgG,IgM五聚體,＊ 單體：膜結(jié)合型——構(gòu)成BCR 五聚體

15、：分泌型——巨球蛋白＊ IgM分子量大，不易透出血管，對防止菌血癥、敗血癥的發(fā)生具有強(qiáng)大的作用。 ＊ 有較多結(jié)合價，是高效能的抗體，其殺菌、溶菌、溶血、促吞噬以及凝集作用比IgG高500倍~1000倍。＊ 產(chǎn)生最早（個體發(fā)育中最早合成，初次體液免疫應(yīng)答中最早產(chǎn)生）,半衰期較短(5天左右) ，故IgM既是宮內(nèi)感染的指標(biāo)，又是傳染病早期診斷的指標(biāo)。,IgA,1、血清型IgA 占血清Ig總量的10－15％2、分泌型IgA（SI

16、gA）＊ 結(jié)構(gòu): J鏈連接的雙體和分泌片 ＊ 分布: 胃腸道和支氣管分泌液、乳汁（初乳中含量最高）、唾液、淚液中 ＊ 功能: 對機(jī)體的局部粘膜(如呼吸道、消化道粘膜)的抗感染免疫有重要作用。 ＊ 新生兒通過母乳喂養(yǎng)，可獲得被動免疫。,IgD＊單體結(jié)構(gòu)；＊血清含量低，占Ig總量的0.2％；半衰期極短，僅3天（鉸鏈區(qū)長）＊ B細(xì)胞表面的IgD（SmIgD）是成熟B細(xì)胞的重要表面標(biāo)志：未成熟B細(xì)胞僅表達(dá)mIgM，成熟B細(xì)

17、胞（初始型）表達(dá)mIgM和mIgD，活化或記憶性B細(xì)胞mIgD逐漸消失。,＊單體結(jié)構(gòu) ＊含量最低，約占Ig總量的0.002% ＊ 黏膜下淋巴組織中的漿細(xì)胞產(chǎn)生 ＊ 與I型超敏反應(yīng)密切相關(guān) FcεRI 為高親和力受體，主要分布在肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞膜上。,IgE,六、免疫球蛋白的生物學(xué)功能,特異性結(jié)合抗原激活補(bǔ)體結(jié)合細(xì)胞通過胎盤和黏膜具有抗原性,六、免疫球蛋白的生物學(xué)功能,,,V區(qū)功能,Ig通過V區(qū)識別并特異性結(jié)合

18、抗原，發(fā)揮免疫效應(yīng)。＊ 結(jié)合抗原的效價 IgG、IgE、IgD：雙價 IgA：4價 IgM：理論上10價，實(shí)際上5價。＊介導(dǎo)免疫效應(yīng)：中和毒素，阻止病原體感染、作為抗原受體識別抗原等。,C區(qū)的功能,1、激活補(bǔ)體 ＊IgG1~3、IgM——經(jīng)典途徑 ＊IgA、IgE、IgG4聚合物——旁路途徑2、結(jié)合細(xì)胞表面的Fc受體（FcR） ＊ 調(diào)理作用：指抗體、補(bǔ)體促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌等顆

19、粒性抗原的作用。 如IgG與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞,＊ 發(fā)揮抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(antibody dependent cell-mdeiated cytotoxicity, ADCC)：指具有殺傷活性的細(xì)胞如NK細(xì)胞通過其表面表達(dá)的Fc受體識別結(jié)合于靶抗原（如病毒感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞）上的抗體Fc段，直接殺傷靶細(xì)胞。 NK細(xì)胞是介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞?？贵w與抗原的結(jié)合是特異性的，而ADCC殺傷作用是非特異性的。

20、 ＊ 介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)：IgE,,,3、穿過胎盤和粘膜： IgG是唯一能穿過人胎盤屏障的免疫球蛋白，對新生兒的免疫具有重要作用。 IgG 通過結(jié)合母體側(cè)滋養(yǎng)層細(xì)胞表面的FcRn，主動轉(zhuǎn)移到胎兒血循環(huán)。 分泌型IgA與粘膜免疫,Ig基因由三組不連鎖的基因群控制，即κ輕鏈基因群（2號）、λ輕鏈基因群（22號）和重鏈基因群（14號）基因重排（ gene rearrangement）在B細(xì)胞發(fā)育過程中，一部分基因片段互相接近，重新

21、排列，形成功能性的Ig基因單位的過程。,七、免疫球蛋白基因,七、免疫球蛋白基因,表：人胚系基因中Ig基因定位與片段,注：括號中為除假基因及無效基因之外的功能基因片段數(shù),基因重排V/D/J/C基因群中各選擇一個片段，組成單個Ig的編碼基因，再轉(zhuǎn)錄翻譯成功能性Ig。Ig基因重排：胚系B細(xì)胞 VH基因(D-J ? V-DJ)重排 ?輕鏈基因(V/J)重排（先是k，重組失敗，λ基因重排）

22、?VDJ或VJ基因與C基因連接，形成mRNA ? 翻譯為重鏈和輕鏈 ? 以二硫鍵組合成Ig,七、免疫球蛋白基因,,,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1987"for his discovery of the genetic principle for generation of ant

23、ibody diversity",Susumu Tonegawa（利川根進(jìn)）,,七、免疫球蛋白基因,七、免疫球蛋白基因：基因重排,重組信號序列 (recombination signal sequence，RSS)是由寡核苷酸組成的七聚體(heptamer) [5‘CACAGTG3’]、九聚體(nonamer) [5‘ACAAAAACC3’]，以及兩者之間較少保守性的間隔序列(spacer)所組成。間隔序列的堿基數(shù)為12或

24、23，在重組酶的識別和作用下，帶有12bp間隔序列的RSS基因片段只能和帶有23bp間隔序列的基因片段結(jié)合，保證了基因片段的正確連接，該現(xiàn)象稱為“12-23規(guī)則”。,七、免疫球蛋白基因,Ig的基因重排信號序列,七、免疫球蛋白基因：基因重排,重組酶 (recombinase)是一組參與V、(D)、J基因片段重組的酶。重組激活基因(recombination activating gene，RAG)編碼重組激活酶，有RAG-1和RAG-2

25、兩種，形成的復(fù)合物是一種內(nèi)切酶，可特異性識別并切除 V、(D)、J基因片段兩側(cè)RSS的保守序列。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)表達(dá)于B細(xì)胞前體，可將數(shù)個核苷酸（N-核苷酸）通過一種非模板編碼(non-template encoded)的方式加到DNA的斷端。其他 還有切開發(fā)夾結(jié)構(gòu)的內(nèi)切酶，參與修復(fù)DNA雙鏈斷端的DNA外切酶、DNA合成酶等。,七、免疫球

26、蛋白基因：基因重排,VDJ 基因重組的結(jié)果：促進(jìn)免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)錄,七、免疫球蛋白基因：類別轉(zhuǎn)換,⑴ 缺失模型⑵ RNA的可變剪接,,七、免疫球蛋白基因,七、免疫球蛋白基因,膜表面Ig（SmIg）和分泌型Ig的基因重排SmIg和分泌性Ig的H鏈結(jié)構(gòu)相類似，所不同的是SmIg的羧基端多含一段穿膜的疏水性氨基酸殘基和胞漿區(qū)。因此SmIgH鏈的轉(zhuǎn)錄本（transcript）要比分泌性IgH鏈轉(zhuǎn)錄本多1～2個外顯子。膜型和分泌型Ig重鏈

27、基因的結(jié)構(gòu)和重排相同，但在RNA水平上的剪接有所不同。,七、免疫球蛋白基因,等位基因排斥現(xiàn)象：早期成熟B細(xì)胞只表達(dá)Ig兩個等位基因中的一個。輕鏈同種型排斥：每個B細(xì)胞合成兩型輕鏈中的一種。,* 組合多樣性* 連接多樣性* 體細(xì)胞高頻突變（B細(xì)胞）,Ig 多樣性的機(jī)制,,1. 組合多樣性：V/D/J/ 的組合及輕重鏈的組合 肽鏈 組合多樣性 連接多樣性

28、 VH VH65 x DH30 x JH6=11700 Vk Vk50 x Jk5 =250 Vl Vl30 x Jl4 = 120 L 250+120 = 370 H+L 2.5 x 108 3 x 107

29、總計(jì) 1014,,,,組合多樣性,,2. 連接多樣性：發(fā)生于胚系基因 CDR3區(qū)位于V/J或V/D/J片段連接處，兩個片段之間的連接點(diǎn)不同或丟失或插入數(shù)個核苷酸及倒轉(zhuǎn)。3. 體細(xì)胞高頻突變造成的多樣性： 成熟B細(xì)胞在受到抗原刺激后，在生發(fā)中心發(fā)生體細(xì)胞高頻突變，多發(fā)生在Ig的CDR區(qū)，若干核苷酸替換突變，利于提高抗體與抗原的親和力。,七、免疫球蛋白基因,免疫球蛋白的多樣性

30、 連接多樣性: P-核苷酸插入 N-核苷酸插入,Junctional diversity,,,Junctional diversity,Somatic hypermutation,八、人工制備抗體,多克隆抗體（polyclonal antibody）單克隆抗體（monoclonal antibody）基因工程抗體（gen engineering Ab）,八、人工制備抗體,多克隆抗體（polyclona

31、l antibody）用含多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)免疫動物，刺激多個B細(xì)胞克隆所獲得的免疫血清（含多種抗體的混合物），此為多克隆抗體。來源廣泛，制備容易；特異性不高，易產(chǎn)生交叉反應(yīng),,,,,,,,帶有多個表位,針對不同表位的B細(xì)胞,克隆增殖,多種抗體的混合物（多克隆抗體）,刺激小鼠,八、人工制備抗體,單克隆抗體單個B細(xì)胞克隆增殖產(chǎn)生的只針對某一特定抗原決定基的抗體稱為單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb），

32、單克隆抗體通過雜交瘤技術(shù)制備所制備的高度均一（屬同一類、亞類、型別），單一特異性（僅針對特定抗 原表位）的抗體，可大量生產(chǎn)。鼠源單克隆抗體可誘導(dǎo)人體產(chǎn)生人抗鼠抗體,,Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody,HAT: 次黃嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T) HGPRT：次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶,八、人工制備抗體,基因工程抗體

33、 借助DNA重組技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，按人們的意愿在基因水平上對Ig進(jìn)行切割、拼接或修飾，重新組裝成為新型抗體分子.,八、人工制備抗體,基因工程抗體嵌合抗體 (chimeric Ab) 小鼠V區(qū)基因 + 人C區(qū)基因 載體 表達(dá)人源化抗體(humanized Ab)即 CDR移植抗體(CDR-grafted Ab) 小鼠CDR基因 ＋ 人V區(qū)框架,

34、,,,八、人工制備抗體,小分子抗體 由Fab和Fv組成的抗體片段，包括Fab單域抗體（ VH和CH1 ），F(xiàn)v （VH和VL ），單鏈抗體（ VH-Linker-VL ）,,,,,,,,,,,,,,,,,,分別構(gòu)建載體,L鏈表達(dá)載體,H鏈表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,Pr VH Pr VL,Fv [二硫鍵穩(wěn)定的Fv (disulf

35、ide-stabilized Fv,ds-Fv)]小分子抗體的制備,,ds-Fv,,,,,,,,,,,,,,,,,,VH VL,接頭DNA (Gly4Ser)3,VH引物,PCR,VH 接頭DNA,酶切、克隆,ScFv (single chain Fv,scFv )的構(gòu)建,,,,,,變性、復(fù)性,VL引物,Sc

36、-Fv,VL,,,,,,雙特異性抗體,,抗原A,抗原B,-S-S-,Fab,VL,,,,,,-S-S-,CH1,,VH,,VL,,,,,Fv,,VH,,VL,,,,,,,,CTL,,CD3,,TUMORCELL,-S-S-,,,,抗原A,抗原B,,,,,Wolf E,Hofmeister H,Kufer P,et al.BiTEs: bispecific antibody constructswith unique anti-tum

37、or activity. Drug Discover Today.2005,10(18):1237-1244,八、人工制備抗體,噬菌體抗體(phage antibody)是將克隆的人Ab V區(qū)基因與絲狀噬菌體DNA上的基因－Ⅲ或Ⅷ精確相連，轉(zhuǎn)染細(xì)菌后在其膜表面表達(dá)Fab-噬菌體外殼蛋白的融合蛋白。其優(yōu)點(diǎn)是： 1.可以不用免疫而直接獲取人源性抗體 2.篩選范圍大 3.快速,噬菌體展示技術(shù)（phage displa

38、y) 用絲狀噬菌體（M13或Fd）：（1）編碼外殼蛋白III基因處插入外來基因，采用噬菌體展示技術(shù)表達(dá)。（2）通過‘吸附-洗脫-擴(kuò)增’富集性選擇過程。轉(zhuǎn)入基因的M13 抗原包被的固相載體 洗滌（去掉不表達(dá)特異Ab

39、 的M13） 洗脫 擴(kuò)增,,,,,吸附,抗體庫的富集篩選,,優(yōu)點(diǎn)：與雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體相比1.可以不用免疫而直接獲取人源性抗體 人淋巴細(xì)胞→mRNA→cDNA→PCR擴(kuò)增H/L鏈基因 →克隆到絲狀噬菌體2.篩選范圍大3.快速,抗體庫的構(gòu)建,八、人工制備抗體,轉(zhuǎn)基因鼠(xe