重組有機(jī)磷水解酶發(fā)酵條件的優(yōu)化和酶制劑的研究.pdf

1、本文進(jìn)行了重組甲基對(duì)硫磷水解酶(MPH)在大腸桿菌(Fscherichia coli)中表達(dá)條件優(yōu)化研究，根據(jù)重組表達(dá)菌株Ecoli B121(DE3)/pET29a-mpd的生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酶情況，在乳糖誘導(dǎo)下，經(jīng)過單因素試驗(yàn)和三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，確定了最適搖瓶培養(yǎng)基成分，并使用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進(jìn)行了7L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，得到了甲基對(duì)硫磷水解酶活力18.69U/mL,酶活在搖瓶培養(yǎng)IPTG誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上提高了10倍。 通過非變性Ni

2、-NTA金屬螯合親和層析對(duì)重組甲基對(duì)硫磷水解酶進(jìn)行了純化，酶的比活提高了64.52倍，整個(gè)純化過程的酶活力回收率為53.63％。純化后的酶經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證為電泳純。測(cè)定了重組甲基對(duì)硫磷水解酶降解甲基對(duì)硫磷的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，25℃時(shí)對(duì)甲基對(duì)硫磷的米氏常數(shù)Km為171.7μmol/L，kcat為30．2S<'-1>，Vmax為12.1μmol·L<'-1>min<'-1>。該酶水解甲基對(duì)硫磷的最適反應(yīng)溫度在15℃，在低溫的條件下MPH的活

3、力比高溫的時(shí)候強(qiáng)；在不同溫度下長(zhǎng)期保存結(jié)果表明，4℃～20℃穩(wěn)定性比較高，20℃以上酶活損失很大；該酶水解甲基對(duì)硫磷的最適反應(yīng)pH為7.5，pH對(duì)酶的穩(wěn)定性有較大的影響，但在pH6．5～pH8．5左右時(shí)穩(wěn)定性較好；在不同pH的環(huán)境下長(zhǎng)期保存，結(jié)果顯示pH6.5為該酶的最適保存pH，pH5.5～pH7.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定。而Fe<'2+>、Cu<'2+>、Co<'2+>、Mn<'2+>對(duì)酶有一定的激活作用，金屬螯合劑1，10-鄰菲洛林和EDT

4、A對(duì)MPH酶的活性基本無抑制作用，rween-20，Tween-80，Triton-100和SDS對(duì)酶的活性有強(qiáng)烈的抑制作用。 對(duì)重組甲基對(duì)硫磷水解酶粗酶液的保存條件進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)聚乙二醇6000、硼酸、Na<,2>CO<,3>、NaCl、檸檬酸鈉、甲酸鈉、甘油、乙醇等物質(zhì)，。對(duì)該酶在液體中的穩(wěn)定性有很好的保護(hù)作用，高濃度的Na<'+>對(duì)重組甲基對(duì)硫磷水解酶的降解活性有促進(jìn)作用。根據(jù)對(duì)重組對(duì)硫磷水解酶粗酶液的穩(wěn)定性的影響，優(yōu)化