弓形蟲(chóng)三磷酸核苷水解酶Ⅱ重組蛋白和單抗的制備與應(yīng)用.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)是一種全球分布的機(jī)會(huì)致病性原蟲(chóng)，可在人和動(dòng)物的所有有核細(xì)胞內(nèi)寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形蟲(chóng)病，孕婦及免疫缺陷人群感染后可引起嚴(yán)重的后果。三磷酸核苷水解酶(nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase)為分布于弓形蟲(chóng)速殖子表面的一種主要特異性抗原，對(duì)蟲(chóng)體在宿主細(xì)胞內(nèi)的寄生和繁殖都具有重要的作用，是弓形蟲(chóng)急性感染階段引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要抗原，NTPa

2、se蛋白有NTPase-Ⅰ和NTPase-Ⅱ兩種亞型，其中NTPase-Ⅰ僅存在于有毒株，而NTPase-Ⅱ存在于所有弓形蟲(chóng)株體內(nèi)[12]，因此NTPase-Ⅱ可用于檢測(cè)候選抗原和候選的保護(hù)性抗原。本研究將對(duì)弓形蟲(chóng)NTPase-Ⅱ基因進(jìn)行原核表達(dá)，探討NTPase-Ⅱ原核表達(dá)蛋白在弓形蟲(chóng)病早期診斷的應(yīng)用，并制備其單克隆抗體，研究單抗對(duì)弓形蟲(chóng)的抑制作用。此外，并構(gòu)建弓形蟲(chóng)NTPase-Ⅱ基因真核表達(dá)載體，為弓形蟲(chóng)核酸疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

3、 目的： 1.誘導(dǎo)表達(dá)弓形蟲(chóng)融合蛋白NTPase-Ⅱ，建立檢測(cè)小鼠血清中剛地弓形蟲(chóng)NTPase-Ⅱ特異性IgG、IgM抗體的間接ELISA法，探討用于弓形蟲(chóng)感染早期檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值。 2.制備、鑒定抗弓形蟲(chóng)融合蛋白NTPase-Ⅱ單克隆抗體，通過(guò)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討單克隆抗體對(duì)弓形蟲(chóng)的抑制作用。 3.構(gòu)建弓形蟲(chóng)NTPase-Ⅱ基因真核表達(dá)載體，為弓形蟲(chóng)核酸疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.NTP

4、ase-Ⅱ基因的原核表達(dá) 用含重組表達(dá)質(zhì)粒NTPase-Ⅱ-pBAD-HisB的E.coli BL21(DE3)在一定條件下在誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖的作用下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 2.重組NTPase-Ⅱ融合蛋白的純化及鑒定 使用Ni離子親和層析柱純化重組質(zhì)粒pBAD-HisB-NTPase表達(dá)產(chǎn)生的含組氨酸的重組融合蛋白，SDS-PAGE鑒定其純度。對(duì)純化蛋白進(jìn)行透析復(fù)性后，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。 3.間接EL

5、ISA檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染鼠NTPase-Ⅱ抗體 以剛地弓形蟲(chóng)NTPase-Ⅱ融合蛋白為包被抗原建立間接ELISA法，動(dòng)態(tài)檢測(cè)剛地弓形蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)感染鼠血清NTPase-Ⅱ特異性IgG、IgM抗體變化，試驗(yàn)設(shè)腦囊蟲(chóng)病、血吸蟲(chóng)病及肺吸蟲(chóng)病病人血清對(duì)照。 4.單克隆抗體的制備及應(yīng)用 用融合蛋白NTPase-Ⅱ作為抗原，免疫BALB/c小鼠，共免疫3次，每次間隔2周，末次免疫后3d取小鼠脾細(xì)胞及Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞在聚乙二醇(PE

6、G1500)作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，有限稀釋法篩選出高滴度分泌McAb的雜交瘤細(xì)胞株，蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)及ELISA分析其特異性，試劑盒測(cè)定其免疫球蛋白亞類(lèi)，初步探討其在弓形蟲(chóng)診斷及治療中的應(yīng)用。 5.NTPase-Ⅱ基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 采用PCR方法擴(kuò)增剛地弓形蟲(chóng)RH株的NTPase-Ⅱ基因，克隆入pGEM-T easy載體，陽(yáng)性克隆經(jīng)酶切與測(cè)序鑒定后亞克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒PVAX1。

7、 結(jié)果： 1.SDS-PAGE結(jié)果表明NTPase-Ⅱ基因在E.coli BL21(DE3)中獲得高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要存在于包涵體中。融合蛋白的相對(duì)分子量(Mr)約70000，與理論值相近。經(jīng)Nj2+-NTA樹(shù)脂純化后純度約為84％。 2.小鼠血清中的抗NTPase-Ⅱ抗體IgM于弓形蟲(chóng)感染后第3d開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，IgG抗體于感染后第7d開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，腦囊蟲(chóng)病、血吸蟲(chóng)病及肺吸蟲(chóng)病病人血清特異性IgG陽(yáng)性率分別為0

8、、1.92％和0。 3.經(jīng)篩選獲得能穩(wěn)定分泌抗弓形蟲(chóng)融合蛋白NTPase-Ⅱ單克隆抗體2株和雜交瘤細(xì)胞2株，分別命名為為MNT1和MNT2； Western blotting顯示2株單克隆抗體均能與弓形蟲(chóng)重組融合蛋白NTPase-Ⅱ發(fā)生特異性結(jié)合，ELISA結(jié)果顯示2株單克隆抗體均能與弓形蟲(chóng)速殖子全蟲(chóng)蛋白及弓形蟲(chóng)重組融合蛋白NTPase-Ⅱ發(fā)生特異性結(jié)合；2株單克隆抗體經(jīng)免疫球蛋白類(lèi)和亞類(lèi)鑒定均為IgG2a；免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明2株

9、單克隆抗體無(wú)法阻止弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞，但卻可抑制弓形蟲(chóng)在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖；動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)2株單抗都有一定的保護(hù)作用；免疫熒光定位結(jié)果顯示2株單克隆抗體與弓形蟲(chóng)的結(jié)合部位主要是在弓形蟲(chóng)膜表面。 4.PCR擴(kuò)增得到特異的剛地弓形蟲(chóng)NTPase-Ⅱ基因序列，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體PVAX1-NTPase，經(jīng)測(cè)序鑒定亞克隆的NTPase-Ⅱ基因序列與Genebank公布的序列同源性為100％。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)成功表達(dá)

10、了弓形蟲(chóng)NTPase-Ⅱ融合蛋白，間接ELISA檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染鼠血清抗體的敏感性和特異性較高，有望應(yīng)用于弓形蟲(chóng)感染的早期檢測(cè)。 2.制備的抗弓形蟲(chóng)融合蛋白NTPase-Ⅱ雜交瘤細(xì)胞株能分泌識(shí)別融合蛋白NTPase-Ⅱ的高特異性單克隆抗體，對(duì)單克隆抗體的初步應(yīng)用顯示其對(duì)弓形蟲(chóng)在宿主細(xì)胞內(nèi)的繁殖具有一定的抑制作用，采用該單抗進(jìn)行被動(dòng)免疫具有一定保護(hù)效果。 3.成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒PVAX1-NTPase-Ⅱ，為弓形蟲(chóng)核酸疫