異源表達(dá)謝瓦散囊菌谷氨酸脫氫酶基因?qū)λ镜卮x影響的研究.pdf

1、氮是植物生長發(fā)育必需的礦質(zhì)元素之一，植物根部吸收的NH4+或NO3-以及體內(nèi)代謝產(chǎn)生的NH4+需轉(zhuǎn)化為有機(jī)態(tài)的氮從而為植物所利用。在植物體內(nèi)存在兩條NH4+同化途徑，即谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)/谷氨酸合成酶(glutamate synthase，GOGAT)途徑和谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)途徑。然而在植物體內(nèi)的GDH對(duì)于NH4+具有較高的Km值，即GDH

2、對(duì)于NH4+的親和能力較弱，使得該途徑對(duì)NH4+的同化過程不能有效進(jìn)行，但GDH途徑消耗的能量較GS/GOGAT途徑少，因此提高植物體內(nèi)GDH對(duì)氮素的同化水平可能是一條植物提高氮素利用效率的有效途徑。水稻（Oryza sativa L.）是我國重要的糧食作物，氮素是構(gòu)成水稻生產(chǎn)成本的主要部分，而水稻氮肥利用率平均僅在28％～37％之間，因此本研究以探索提高水稻氮素利用效率的可能途徑為目標(biāo)，從謝瓦散囊菌（Eurotium cheralie

3、r）中克隆到一個(gè)GDH基因(命名為EcGDH)，并對(duì)該基因進(jìn)行相關(guān)研究，研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.利用生物信息學(xué)方法對(duì)EcGDH進(jìn)行同源性分析及進(jìn)化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，EcGDH與黑孢酶屬(Nigrospora) GDH基因(NiGDH)有較高的同源性，與水稻GDH基因同源性較低。通過對(duì)EcGDH氨基酸序列分析可知EcGDH屬于NADPH型GDH，該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于穩(wěn)定型疏水性蛋白。
　　 2.從謝瓦散囊菌中克隆到E

4、cGDH基因，大小約為1380 bp，測序鑒定與預(yù)期相符。
　　 3.構(gòu)建原核表達(dá)載體pCold-EcGDH，并對(duì)該基因的體外誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)重組蛋白pCold-EcGDH的最佳誘導(dǎo)條件為IPTG終濃度0.2 mmol/L、16℃誘導(dǎo)12h。通過Western blotting進(jìn)一步鑒定融合了His-tag的重組蛋白為所需的目的蛋白。進(jìn)而利用分光光度法，對(duì)EcGDH酶活力檢測可知，EcGDH對(duì)NH4+的Km值為6.06

5、±0.33 mmol/L，EcGDH對(duì)α-酮戊二酸的Km值為8.13±0.45 mmol/L，由此說明EcGDH具有谷氨酸脫氫酶活性。
　　 4.構(gòu)建pCAMBIA1301-EcGDH植物過表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌浸染水稻愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)過抗性篩選及分子鑒定得到兩個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因水稻株系:Ubi∷EcGDH-12和Ubi∷EcGDH-13。
　　 5.通過設(shè)置低氮(200μmol NH4NO3)和高氮(2000μmo

6、l NH4NO3)的兩個(gè)不同氮素濃度對(duì)陽性轉(zhuǎn)基因植株氮脅迫水培試驗(yàn)結(jié)果表明，在低氮濃度下，Ubi∷EcGDH轉(zhuǎn)基因植株的總氮含量較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ赵黾恿?2.7％。同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)NADP(H)-GDH酶活測定的結(jié)果表明，外源固氮基因EcGDH的轉(zhuǎn)入促進(jìn)了水稻體內(nèi)NH4+同化進(jìn)程。大田栽培試驗(yàn)表明，Ubi∷EcGDH轉(zhuǎn)基因水稻株系的株高增加較明顯，有效穗數(shù)和單株產(chǎn)量也有不同程度的增加，但是結(jié)實(shí)率和千粒重變化不明顯。雖然未獲得生長具有明顯