馬拉色菌對(duì)培養(yǎng)人黑素細(xì)胞代謝及酪氨酸酶基因表達(dá)的影響.pdf

1、[目的]：馬拉色菌感染所致花斑癬的基本皮膚損害包括色素減退和/或色素沉著，皮膚色素改變除考慮個(gè)體差異性外，是否與不同菌種或菌株的生物學(xué)特性差異有關(guān)?本課題將①馬拉色菌與角質(zhì)形成細(xì)胞共同培養(yǎng)后的上清和②馬拉色菌分別加入黑素細(xì)胞培養(yǎng)體系中，探討馬拉色菌對(duì)培養(yǎng)人黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性、黑素含量及酪氨酸酶mRNA表達(dá)的影響。 [方法]：將人包皮表皮細(xì)胞懸液用MCDB153培養(yǎng)基添加佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol

2、-14-acetate，TPA)、霍亂毒素(Choleratoxin，CT)、重組人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(recombinanhumanepidermalgrowthfactor，rhEGF)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Isobutylmethylxanthine，IBMX)等進(jìn)行黑素細(xì)胞純化培養(yǎng)。用多巴染色、Fontana銀染和S-100蛋白免疫組化染色法鑒定培養(yǎng)的黑素細(xì)胞。利用氧化反應(yīng)原理建立酪氨酸酶活性檢測(cè)體系。將7種馬拉色菌分別與

3、角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCat)共同培養(yǎng)24小時(shí)后，獲得共同培養(yǎng)上清液，按1：1，1：3，1：7(上清體積：黑素細(xì)胞培養(yǎng)液體積)加入黑素細(xì)胞培養(yǎng)體系中，24小時(shí)后觀察黑素細(xì)胞增殖情況(MTT法)、測(cè)定酪氨酸酶活性(氧化多巴反應(yīng))、黑素含量(NaOH溶解法)、酪氨酸酶mRNA的表達(dá)(實(shí)時(shí)熒光定量PCR法)以及超微結(jié)構(gòu)的變化。 [結(jié)果]：1.建立了黑素細(xì)胞純化培養(yǎng)體系，能在體外培養(yǎng)及傳代5次。多巴染色、Fontana銀染和S-100蛋白

4、免疫組化染色均證實(shí)為黑素細(xì)胞。2.酪氨酸酶活性檢測(cè)體系穩(wěn)定可靠。最適反應(yīng)緩沖液為pH9.0、0.25mol/LTris-HCl；底物左旋多巴最大溶解度為0.15％，使用pH8.0、0.01mol/LTris-HCl溶解；在配制反應(yīng)底物左旋多巴時(shí)加入0.03％H2O2可提高反應(yīng)的敏感性：酪氨酸酶活性檢出的最適細(xì)胞數(shù)為≥2.5×104個(gè)，反應(yīng)高峰出現(xiàn)在20分鐘之內(nèi)，且與黑素細(xì)胞數(shù)有關(guān)，細(xì)胞數(shù)越多，反應(yīng)高峰出現(xiàn)的時(shí)間越早。3.黑素細(xì)胞經(jīng)球形馬

5、拉色菌與角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCat)共同培養(yǎng)24小時(shí)的上清處理24小時(shí)后，酪氨酸酶活性較對(duì)照組增加，每分鐘內(nèi)酶變化A450值從1.298±0.046增至1.559±0.059；黑素含量亦較對(duì)照組增加，從6.593±0.852mg/L增至13.715±0.811mg/L；酪氨酸酶mRNA的表達(dá)亦較對(duì)照組增強(qiáng)，熒光定量PCR結(jié)果用酪氨酸酶(TYR)基因擴(kuò)增熒光強(qiáng)度與內(nèi)參照三磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)基因擴(kuò)增熒光強(qiáng)度之比表示，其值從0.91

6、1±0.562增至35.445±26.297；超微結(jié)構(gòu)顯示，黑素細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)豐富的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體及大量的黑素顆粒。4.黑素細(xì)胞經(jīng)除球形馬拉色菌外的其他6種馬拉色菌與角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCat)共同培養(yǎng)24小時(shí)的上清處理24小時(shí)后，酪氨酸酶活性、黑素含量、酪氨酸酶mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5.黑素細(xì)胞經(jīng)7種馬拉色菌直接刺激24小時(shí)后，酪氨酸酶活性較對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 [結(jié)論]：1.球形馬拉色菌與角質(zhì)形成細(xì)

7、胞株(HaCat)共同培養(yǎng)24小時(shí)的上清刺激黑素細(xì)胞24小時(shí)后在蛋白質(zhì)水平能提高酪氨酸酶活性和黑素含量，在基因水平能提高酪氨酸酶mRNA的表達(dá)，超微結(jié)構(gòu)顯示，胞漿內(nèi)有豐富的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體及大量的黑素顆粒，表明其黑素代謝增加。2.除球形馬拉色菌外的其他6種馬拉色菌與角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCat)共同培養(yǎng)24小時(shí)的上清處理黑素細(xì)胞24小時(shí)后，其酪氨酸酶活性、黑素含量、酪氨酸酶mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)改變。3.馬拉色菌直接刺激黑素細(xì)