MRI評價腺病毒介導的酪氨酸酶基因在HepG2細胞表達的實驗研究.pdf

1、研究背景： 基因治療作為一種新的治療方法，被認為是醫(yī)學科學中最新、最有潛力和最可能發(fā)生革命性變化的領(lǐng)域。目前，基因治療亟待解決的問題是在如何在活體實時、無創(chuàng)傷地檢測目的基因的表達、分布和治療的療效。分子影像學通過反映機體內(nèi)細胞和分子水平的改變，能夠在活體上對基因治療效果進行評價，而不影響其生理活動，具有遠大的前景。目前基因表達顯像應用的主要技術(shù)手段包括：核醫(yī)學、MRI、光學成像。由于MRI空間分辨率高(已達μm級)，設(shè)備比較普及

2、，同時可獲得解剖及生理信息，MRI分子影像學成為近年來的研究熱點。MRI分子影像學以報告基因為基礎(chǔ)，報告基因即基因的表達產(chǎn)物能與攜帶影像學標記物的分子探針特異性結(jié)合，從而可為影像學設(shè)備所檢測到的基因。其中一個熱點研究的報告基因是酪氨酸酶基因，酪氨酸酶是催化合成黑色素的關(guān)鍵酶。黑色素是一種陰離子，能與鐵等金屬高效結(jié)合，降低了金屬回旋的相關(guān)性時間，使MR的T1弛豫時間變短，表現(xiàn)為特征性的T1加權(quán)像高信號。 基因治療的關(guān)鍵技術(shù)是轉(zhuǎn)染，

3、轉(zhuǎn)染需要合適的載體。目前研究用的是非病毒載體，雖然非病毒載體具有簡便、安全、容量高的優(yōu)點，但轉(zhuǎn)染效率低且缺乏細胞特異性，應用受到限制。為了進一步研究酪氨酸酶—黑色素報告基因系統(tǒng)，我們需要尋找一種高效的載體。由于腺病毒具有許多優(yōu)點，如使用安全，制備容易，能獲得高純度、高滴度的腺病毒載體；以游離型存在，不整合進入宿主DNA中，無遺傳毒性；表達時間短暫，一般15-20天，適合—過性表達的需要；載導容量相對較大，理論上可攜帶37kb的DNA；感

4、染宿主范圍較廣，處于靜止期的細胞也能感染。本研究以酪氨酸酶基因腺病毒重組體轉(zhuǎn)染HepG2細胞，觀察腺病毒載體運送酪氨酸酶基因轉(zhuǎn)染體外細胞的效果。 研究目的： 觀察酪氨酸酶基因腺病毒重組體轉(zhuǎn)染HepG2細胞的效果及黑色素的表達情況。 1、構(gòu)建酪氨酸酶基因腺病毒重組體。 2、利用酪氨酸酶基因腺病毒重組體轉(zhuǎn)染HepG2細胞。 3、檢測轉(zhuǎn)染細胞DNA內(nèi)報告基因?qū)肭闆r及轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)黑色素表達情況。

5、4、利用磁共振成像(MRI)對轉(zhuǎn)染細胞進行掃描，觀察轉(zhuǎn)染細胞的信號特征。 材料和方法： 一、酪氨酸酶基因轉(zhuǎn)染 1、構(gòu)建酪氨酸酶基因腺病毒重組體，委托東方肝膽外科醫(yī)院病毒基因治療室代為合成，pcDNA3tyr質(zhì)粒由美國哈佛分子影像中心Simonova博士惠贈。 2、HepG2細胞的培養(yǎng) 用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，每2-3天換液一次。采用100mm直徑的一次性培養(yǎng)皿，待細胞匯合50％約1

6、06個細胞且處于對數(shù)生長期時使用。 3、轉(zhuǎn)染 細胞生長達到106個時以無血清高糖DMEM培養(yǎng)液換液，在1～4號培養(yǎng)皿中分別加入空白腺病毒載體及MOI為50、150、300的ad—tyr，作為對照組及實驗組。轉(zhuǎn)染6小時后吸去含病毒培養(yǎng)液，PBS輕柔沖洗(2×4 ml)后換以含10％胎牛血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)72小時后以胰酶消化，行后續(xù)檢測。5號培養(yǎng)皿加入綠色熒光蛋白基因重組腺病毒。 二、MRI成像 胰酶消化后獲取

7、細胞懸液(經(jīng)計數(shù)為106個細胞)，1200rpm離心5分鐘使之沉淀于EP管底，仔細吸除上清后將1～4號離心管平行放置，分別代表空白對照及MOI為50、150、300轉(zhuǎn)染病毒的細胞團。行T1WI(TR/TE500/15ms)、T2WI(TR/TE2600/100ms)、STIR(TR/TE432/60ms)序列檢查，掃描線圈采用C3線圈，內(nèi)徑11cm，矩陣400×432，F(xiàn)ov15cm×15cm，層厚1.5mm，層距—0.7mm。

8、 三、轉(zhuǎn)染細胞的驗證 結(jié)果： 1.MRI檢查結(jié)果 對轉(zhuǎn)染細胞團進行T1WI、T2WI、STIR檢查，轉(zhuǎn)染細胞團均出現(xiàn)高信號，空白對照細胞團未見高信號或僅出現(xiàn)微弱高信號，并呈現(xiàn)一種趨勢，轉(zhuǎn)染病毒量越大，信號越高。至MOI150以后，其信號增高不再明顯。 2.黑色素染色 轉(zhuǎn)染細胞染色較深，呈深褐色，胞漿內(nèi)可見大量黑褐色顆粒?？瞻讓φ占毎麅?nèi)缺乏上述深褐色染色。 3.Real—Time PCR

9、 1～4號樣品中酪氨酸酶基因(Tyr)的表達量差異倍數(shù)分別為1、62.55、617.34、612.25。實驗組的酪氨酸酶基因(Tyr)的表達量相對空白對照組顯著提高。 4.綠色熒光成像在熒光顯微鏡檢測中，絕大部分經(jīng)綠色熒光蛋白基因腺病毒重組體轉(zhuǎn)染的HepG2細胞內(nèi)都可見綠色熒光。 結(jié)論： 1、腺病毒作為運送載體可以高效地運送酪氨酸酶基因進入HepG2細胞并成功表達。 2、酪氨酸酶基因作為報告基因，利用