一種綠僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的基因克隆、表達(dá)及其特性分析.pdf

1、本文以金龜子綠僵菌蝗變種(Metarhizium anisopliae var.acridum)CQMa102菌株的總RNA為模板，以RT、1P5和1P3、2P5和2P3為引物，在體外通過(guò)RT-PCR的方式成功克隆出了該菌酪氨酸蛋白磷酸酶的表達(dá)基因序列。將該基因片段克隆到表達(dá)載體pPIC9K中，轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71，并用0.5％的甲醇對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)144h后的粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE和酶特性分析，結(jié)果表明重組PD在畢赤酵

2、母中表達(dá)出了酪氨酸蛋白磷酸酶。有研究已經(jīng)表明，該酶在體外能改變其寄主(蝗蟲(chóng))血淋巴中與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白(Toll-likereceptor)的磷酸化狀態(tài)，進(jìn)而可能干涉寄主體內(nèi)免疫活動(dòng)。因此，本研究將為從蛋白水平分析綠僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶對(duì)蝗蟲(chóng)體液免疫防御的影響和探討病原真菌干擾寄主體液免疫的可能機(jī)制提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 全文的主要結(jié)論如下：
　　 一、綠僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆
　　 根據(jù)綠僵菌酪氨酸蛋白

3、磷酸酶基因的已知序列設(shè)計(jì)引物，從綠僵菌的總RNA中擴(kuò)增出一條1900bp左右的基因片段。將該基因片段和pMD19-T質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，結(jié)合PCR方法篩選陽(yáng)性克隆。其基因片段的序列分析結(jié)果表明該基因片段共1960bp，含有引物中的2個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)和6個(gè)組氨酸標(biāo)記；而且該基因片段中含有綠僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的表達(dá)基因，可編碼一個(gè)含647個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)氨基酸序列中還包含酪氨酸蛋白磷酸酶質(zhì)譜測(cè)序獲得的有5段肽段氨基

4、酸序列即：DITNFFGVKEPEVEK，WYEDLFAEDK，GNDSALDLPGLK，NIQYGTGVNFPSNWEPR，ALGDLLEELDDTVR；證明克隆正確。
　　 二、畢赤酵母的表達(dá)重組載體的構(gòu)建
　　 根據(jù)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)和要求，選用pPIC9K質(zhì)粒載體連接目的基因，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，結(jié)合PCR方法篩選陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆的測(cè)序分析結(jié)果表明目的基因已經(jīng)插入pPIC9K質(zhì)粒的開(kāi)放閱讀框內(nèi)，且目的基因的

5、5’端連接在pPIC9K質(zhì)粒的信號(hào)端，證明目的基因的畢赤酵母表達(dá)重組載體已經(jīng)構(gòu)建成功。
　　 三、目的基因的整合及其高效表達(dá)菌株的篩選
　　 用電轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的畢赤酵母重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母KM71，并結(jié)合遺傳霉素抗性和PCR方法篩選陽(yáng)性克隆。挑取不同遺傳霉素抗性的陽(yáng)性克隆進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)不同時(shí)間段的培養(yǎng)液進(jìn)行透析、ρNPP底物的相對(duì)酶活性測(cè)定。其培養(yǎng)液相對(duì)酶活性測(cè)定的分析結(jié)果表明，抗遺傳霉素濃度為3.0mg/m

6、l的14號(hào)菌株的培養(yǎng)液相對(duì)酶活性明顯高于其他菌株，且該菌株培養(yǎng)144h時(shí)的培養(yǎng)液相對(duì)酶活性最高，證明14號(hào)菌株有可能高效表達(dá)目的蛋白。
　　 四、粗酶液的SDS-PAGE及其酶特性分析
　　 粗酶液經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析得到一條75.6KDa的蛋白質(zhì)片段，與目的基因表達(dá)的酪氨酸蛋白磷酸酶的分子量大致相同。酶底物特異性分析表明粗酶液中的磷酸酶對(duì)磷酸酪氨酸殘基的專(zhuān)一性較強(qiáng)，Cu2+可明顯抑制該粗酶液對(duì)8mM PNPP的水解

7、作用，Ca2+可促進(jìn)該粗酶液對(duì)8mM pNPP的水解作用，而Mg2+、Ni2+、Mn2+對(duì)該粗酶液水解8mM PNPP的活性影響不明顯；而且絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶專(zhuān)性抑制劑NaF、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶抑制劑EDTA對(duì)磷酸酶酶解pNPP活性沒(méi)有明顯的抑制作用，酸性磷酸酶的特異性抑制劑酒石酸鈉也對(duì)該粗酶液酶解ρNPP活性影響不明顯；但酪氨酸蛋白磷酸酶抑制劑鉬酸鈉和鎢酸鈉顯著抑制酶對(duì)ρNPP的酶解活性，證明目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)是酪氨酸蛋白