東亞飛蝗和金龜子綠僵菌幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達研究.pdf

1、幾丁質(zhì)是昆蟲表皮和圍食膜的重要組成成分，昆蟲生長、發(fā)育的各個時期都需要一定量的幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)代謝隨昆蟲不同生長發(fā)育階段而變化并保持相對的穩(wěn)定，對昆蟲的正常生長發(fā)育是至關(guān)重要的。同時，穿透體壁是在昆蟲病原真菌感染寄主的重要過程之一。幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物或者生防微生物(如Bt或病毒1中表達，增加抗蟲或殺蟲效果。為此有必要加強幾丁質(zhì)酶的研究，為利用基因工程技術(shù)改良菌株奠定基礎(chǔ)并提供目的基因。本文通過PCR方法分別從東亞飛蝗 Locusta m

2、igratoria manilensi和金龜子綠僵菌蝗變種Metarhizium anisopliae vat． acridum菌株CQMa102中克隆了幾丁質(zhì)酶基因，構(gòu)建了酵母表達載體，通過畢赤酵母對獲得的兩個幾丁質(zhì)酶基因進行了表達研究，取得了如下進展： ①東亞飛蝗中腸幾丁質(zhì)酶(LmChi)基因的克隆通過RACE方法，克隆了東亞飛蝗中腸幾丁質(zhì)酶(LmChi)cDNA全序列(登錄號：EF092841)。獲得的cDNA全長1604

3、 bp，其中開放閱讀框1452 bp，編碼483個氨基酸。編碼的氨基酸序列與18家族昆蟲幾丁質(zhì)酶有較高的相似性。與其他幾丁質(zhì)酶一樣，東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶序列也包含一個信號肽、一個幾丁質(zhì)酶活性位點、一個碳端絲氨酸富集區(qū)和一個幾丁質(zhì)結(jié)合域。 ②LmChi基因的組織定位針對昆蟲幾丁質(zhì)酶基因時序性表達的特點，本研究通過半定量RT—PCR法研究LmChi基因的組織表達情況。結(jié)果表明，LmChi基因只在東亞飛蝗不同發(fā)育階段的中腸組織中表達，而在

4、東亞飛蝗體壁、前腸和后腸均沒有發(fā)現(xiàn)．LmChi基因的轉(zhuǎn)錄。 ③金龜子綠僵菌蝗變種菌株CQMa102幾丁質(zhì)酶(MaChi)基因的克隆通過RACE和篩選基因組文庫等方法，克隆了金龜子綠僵菌蝗變種菌株CQMa102幾丁質(zhì)酶(MaChi)基因的DNA和cDNA序列。部分序列已經(jīng)登錄到NCBI數(shù)據(jù)庫中(GenBank登錄號：DQ097518)。MaChi基因DNA全序列1973 bp，其中有三段內(nèi)含子。cDNA全序列1483 bp，蛋白編

5、碼區(qū)長1275 bp，5’端非翻譯區(qū)121 bp，3’端非翻譯區(qū)80 bp。編碼的氨基酸序列與18家族幾丁質(zhì)酶有較高的相似性。同LmChi 一樣，綠僵菌幾丁質(zhì)酶序列也包含一個信號肽、一個幾丁質(zhì)酶活性位點。但沒有幾丁質(zhì)結(jié)合域。 ④LmChi基因和MaChi基因在畢赤酵母中的表達分別將LmChi基因和MaChi基因的成熟肽編碼框連接到表達載體pPIC9K的多克隆位點上，構(gòu)建了pPIC9K-LmChi和pPIC9K-MaChi重組表達