東亞飛蝗和金龜子綠僵菌幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、幾丁質(zhì)是昆蟲(chóng)表皮和圍食膜的重要組成成分，昆蟲(chóng)生長(zhǎng)、發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都需要一定量的幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)代謝隨昆蟲(chóng)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段而變化并保持相對(duì)的穩(wěn)定，對(duì)昆蟲(chóng)的正常生長(zhǎng)發(fā)育是至關(guān)重要的。同時(shí)，穿透體壁是在昆蟲(chóng)病原真菌感染寄主的重要過(guò)程之一。幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物或者生防微生物(如Bt或病毒1中表達(dá)，增加抗蟲(chóng)或殺蟲(chóng)效果。為此有必要加強(qiáng)幾丁質(zhì)酶的研究，為利用基因工程技術(shù)改良菌株奠定基礎(chǔ)并提供目的基因。本文通過(guò)PCR方法分別從東亞飛蝗 Locusta m

2、igratoria manilensi和金龜子綠僵菌蝗變種Metarhizium anisopliae vat． acridum菌株CQMa102中克隆了幾丁質(zhì)酶基因，構(gòu)建了酵母表達(dá)載體，通過(guò)畢赤酵母對(duì)獲得的兩個(gè)幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了表達(dá)研究，取得了如下進(jìn)展： ①東亞飛蝗中腸幾丁質(zhì)酶(LmChi)基因的克隆通過(guò)RACE方法，克隆了東亞飛蝗中腸幾丁質(zhì)酶(LmChi)cDNA全序列(登錄號(hào)：EF092841)。獲得的cDNA全長(zhǎng)1604

3、 bp，其中開(kāi)放閱讀框1452 bp，編碼483個(gè)氨基酸。編碼的氨基酸序列與18家族昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶有較高的相似性。與其他幾丁質(zhì)酶一樣，東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶序列也包含一個(gè)信號(hào)肽、一個(gè)幾丁質(zhì)酶活性位點(diǎn)、一個(gè)碳端絲氨酸富集區(qū)和一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域。 ②LmChi基因的組織定位針對(duì)昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因時(shí)序性表達(dá)的特點(diǎn)，本研究通過(guò)半定量RT—PCR法研究LmChi基因的組織表達(dá)情況。結(jié)果表明，LmChi基因只在東亞飛蝗不同發(fā)育階段的中腸組織中表達(dá)，而在

4、東亞飛蝗體壁、前腸和后腸均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)．LmChi基因的轉(zhuǎn)錄。 ③金龜子綠僵菌蝗變種菌株CQMa102幾丁質(zhì)酶(MaChi)基因的克隆通過(guò)RACE和篩選基因組文庫(kù)等方法，克隆了金龜子綠僵菌蝗變種菌株CQMa102幾丁質(zhì)酶(MaChi)基因的DNA和cDNA序列。部分序列已經(jīng)登錄到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中(GenBank登錄號(hào)：DQ097518)。MaChi基因DNA全序列1973 bp，其中有三段內(nèi)含子。cDNA全序列1483 bp，蛋白編

5、碼區(qū)長(zhǎng)1275 bp，5’端非翻譯區(qū)121 bp，3’端非翻譯區(qū)80 bp。編碼的氨基酸序列與18家族幾丁質(zhì)酶有較高的相似性。同LmChi 一樣，綠僵菌幾丁質(zhì)酶序列也包含一個(gè)信號(hào)肽、一個(gè)幾丁質(zhì)酶活性位點(diǎn)。但沒(méi)有幾丁質(zhì)結(jié)合域。 ④LmChi基因和MaChi基因在畢赤酵母中的表達(dá)分別將LmChi基因和MaChi基因的成熟肽編碼框連接到表達(dá)載體pPIC9K的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建了pPIC9K-LmChi和pPIC9K-MaChi重組表達(dá)