金龜子綠僵菌侵染東亞飛蝗翅膀和血淋巴時(shí)期基因的鑒定.pdf

1、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)是一類應(yīng)用廣泛的昆蟲病原真菌，在昆蟲防治中起著重要作用。與化學(xué)農(nóng)藥相比，真菌殺蟲劑盡管安全，專一性好，無環(huán)境污染，但存在著殺蟲速率慢的弱點(diǎn)，這在很大程度上阻礙了真菌殺蟲劑的應(yīng)用。金龜子綠僵菌侵染寄主昆蟲時(shí)，孢子萌發(fā)后會(huì)形成附著胞——一種重要的侵染器官，能夠分泌多種蛋白酶降解昆蟲體壁，并產(chǎn)生膨脹壓幫助侵染釘刺穿體壁。侵入體內(nèi)后，為了逃避寄主自身的免疫保護(hù)反應(yīng)，金龜子綠僵菌會(huì)發(fā)生形

2、態(tài)改變并適應(yīng)體內(nèi)的高滲透壓，同時(shí)消耗寄主的營養(yǎng)提供自己生長，最后致死寄主。附著胞的形成及分化及其體內(nèi)定殖階段在金龜子綠僵菌侵染過程中發(fā)揮著重要作用，對(duì)這兩個(gè)階段病原真菌的致病機(jī)制研究可為發(fā)展新型高效真菌殺蟲劑提供依據(jù)。
　　 國內(nèi)外許多研究者對(duì)綠僵菌侵染昆蟲體表和體內(nèi)的基因進(jìn)行了深入研究，采用的方法是往液體培養(yǎng)基中加入昆蟲表皮提取物或者直接用無寄主血細(xì)胞的淋巴來培養(yǎng)綠僵菌，然后構(gòu)建綠僵菌的cDNA文庫進(jìn)行EST測序分析。綠僵菌在

3、離體的液體培養(yǎng)環(huán)境下生長時(shí)處于腐生生活階段，而綠僵菌在侵染昆蟲體表時(shí)處于寄生生活階段，在這兩種生長條件下綠僵菌的基因表達(dá)譜肯定會(huì)存在較大差別。本文用金龜子綠僵菌CQMa102為模式生物，一方面以生長于東亞飛蝗翅膀，且處于附著胞形成分化階段的材料作為Tester，而以體內(nèi)定殖階段的材料為Driver，采用抑制消減雜交方法構(gòu)建消減文庫；另一方面用體內(nèi)定殖階段的綠僵菌作為實(shí)驗(yàn)材料，用SMART技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫。通過測序和生物信息學(xué)分析，為

4、后期的毒力基因鑒定提供候選基因。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.選擇金龜子綠僵菌CQMa102在蝗蟲翅膀生長的材料為Tester，在蝗蟲體內(nèi)定殖時(shí)期的材料為Driver，采用抑制消減雜交方法成功構(gòu)建消減文庫；
　　 2.隨機(jī)從差減文庫中挑取1890個(gè)克隆進(jìn)行斑點(diǎn)雜交篩選，得到460個(gè)陽性克隆，測序獲得329條質(zhì)量較好的ESTs，代表78條非冗余序列；
　　 3.在GenBank上用BLASTx對(duì)其進(jìn)

5、行序列同源性比對(duì)。結(jié)果表明32條ESTs編碼產(chǎn)物與己知蛋自質(zhì)序列同源性較低或找不到任何同源序列，46條ESTs與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白序列有明顯的同源性，其中24條己知功能的同源ESTs涉及多種代謝和應(yīng)答過程，包含在細(xì)胞代謝、蛋白代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能以及參與脅迫和抵抗等方面；
　　 4.采用RT-PCR方法驗(yàn)證SSH的結(jié)果，結(jié)果表明隨機(jī)選擇的12條EST序列均在蝗蟲翅膀生長分化階段差異表達(dá)，從而驗(yàn)證SSH結(jié)果的有效性；
　　

6、5.收集綠僵菌在蝗蟲體內(nèi)定殖時(shí)期(包括第3、4、5、6、7天混合有血淋巴細(xì)胞的菌體)的材料，再從中分離得到純凈的菌體，以此為材料采用SMART技術(shù)構(gòu)建全長cDNA文庫；
　　 6.通過斑點(diǎn)雜交方法從全長cDNA文庫中篩選克隆測序，共獲得396個(gè)單克隆，生物信息學(xué)分析表明共有318條質(zhì)量較好的序列，代表187條unigenes，其中有22條序列跟已知功能基因相似度較高(E≤1e-5)，分別包含在細(xì)胞代謝、蛋白代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能以