實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)東亞飛蝗體內(nèi)綠僵菌的方法研究.pdf

1、昆蟲(chóng)病原真菌在生物防治中有重要作用。金龜子綠僵菌能侵染多種鱗翅目昆蟲(chóng)，廣泛用于生物防治，是最常用的生物農(nóng)藥之一。但是真菌農(nóng)藥存在菌株選育困難、菌株毒力下降、生產(chǎn)工藝研制滯后、缺乏質(zhì)量控制體系等問(wèn)題，這嚴(yán)重制約著殺蟲(chóng)真菌農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的形成與發(fā)展，其主要原因之一是缺乏快速準(zhǔn)確的毒力評(píng)價(jià)方法。昆蟲(chóng)病原真菌的致病機(jī)制十分復(fù)雜，但是病原真菌菌體在寄主體內(nèi)快速增殖是寄主昆蟲(chóng)罹病死亡的前提，其增殖數(shù)量及速率直接影響致病過(guò)程及殺蟲(chóng)效率。建立昆蟲(chóng)體內(nèi)病原真菌

2、的早期定量檢測(cè)方法，迅速定量檢測(cè)蝗蟲(chóng)體內(nèi)病原真菌的數(shù)量，確定病原真菌的侵染速度和在蝗蟲(chóng)體內(nèi)變化趨勢(shì)，能滿(mǎn)足菌株選育、制劑研制以及制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)與監(jiān)控中對(duì)殺蟲(chóng)劑毒力評(píng)價(jià)的需要，為我國(guó)生物農(nóng)藥的生產(chǎn)、研發(fā)和檢測(cè)提供技術(shù)支持。 本文研究包括：a)從東亞飛蝗血淋巴中獲取適合PCR擴(kuò)增的綠僵菌DNA；b)建立東亞飛蝗體內(nèi)綠僵菌的熒光定量PCR檢測(cè)體系。 主要研究結(jié)果如下： 1.利用數(shù)碼生物顯微鏡觀(guān)察了CQMa102分生孢子萌

3、發(fā)侵染東亞飛蝗的過(guò)程。在接種綠僵菌60h以?xún)?nèi)的蝗蟲(chóng)血淋巴中未發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)菌體。在接種72h時(shí)，東亞飛蝗血淋巴中開(kāi)始出現(xiàn)綠僵菌蟲(chóng)菌體，從接種72h到96h，蝗蟲(chóng)血淋巴中的綠僵菌蟲(chóng)菌體逐漸增多，蝗蟲(chóng)臨死前，血液中充滿(mǎn)綠僵菌，幾乎找不到蝗蟲(chóng)血細(xì)胞。 2. 設(shè)計(jì)了特異性較好的引物。根據(jù)綠僵菌核糖體DNA（rDNA）的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和5.8S的基因序列，設(shè)計(jì)能準(zhǔn)確區(qū)分東亞飛蝗和綠僵菌基因組DNA的特異引物，該引物適于用SYBR Green

4、 I為熒光來(lái)源的定量PCR方法檢測(cè)東亞飛蝗體內(nèi)的綠僵菌。 3. 建立了定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。用多種試劑進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合度和PCR的擴(kuò)增效率選出最佳試劑為：Bio－rad公司的iQTM SYBR Green supermix。以10倍稀釋的綠僵菌DNA為模板，用該試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，定量范圍達(dá)到6個(gè)數(shù)量級(jí)(1×10-7μg至10－2μg的綠僵菌DNA)，定量的檢測(cè)底線(xiàn)是10－7μg/25μl體

5、系 。 4．優(yōu)化了從感病蝗蟲(chóng)血淋巴中快速制備綠僵菌DNA方法。使用巰基化合物預(yù)處理、雙酶解破壁，能在較短時(shí)間（2h）里使綠僵菌細(xì)胞壁完全破裂；微濾柱過(guò)柱，能去除PCR抑制物質(zhì)，得到適合于定量PCR檢測(cè)的DNA模板，并對(duì)該方法的穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)試，5次重復(fù)的變異系數(shù)僅為0.015，說(shuō)明該方法穩(wěn)定性較好。 5.供試蝗蟲(chóng)體重對(duì)PCR測(cè)試結(jié)果的影響。研究發(fā)現(xiàn)：在0.6-0.8g體重范圍內(nèi)，東亞飛蝗的體重對(duì)定量PCR測(cè)試影響不大，該

6、體重范圍的健康雄蟲(chóng)占健康雄蟲(chóng)總數(shù)的80％以上。 6．供試蝗蟲(chóng)蟲(chóng)齡對(duì)PCR測(cè)試結(jié)果的影響。研究表明：蟲(chóng)齡對(duì)PCR測(cè)試結(jié)果影響較大。羽化后12h的蝗蟲(chóng)，綠僵菌易侵染，測(cè)試Ct值較小，但蝗蟲(chóng)個(gè)體差異大，測(cè)試結(jié)果穩(wěn)定性差；羽化后36h的蝗蟲(chóng)測(cè)試結(jié)果穩(wěn)定，但綠僵菌侵染較慢，Ct值較大，綜合考慮檢測(cè)靈敏性和穩(wěn)定性，認(rèn)為羽化后24h的健康雄性蝗蟲(chóng)最適合定量檢測(cè)。 7.測(cè)定了綠僵菌在蝗蟲(chóng)體內(nèi)生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。研究表明：在接種36h可以