實時熒光定量PCR檢測陰道加德納菌和乳酸桿菌的方法學(xué)建立及其臨床應(yīng)用.pdf

1、目的： 采用SYBR Green技術(shù)，建立實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)檢測陰道加德納菌和乳酸桿菌的方法學(xué)，對細(xì)菌性陰道病患者陰道分泌物中陰道加德納菌和乳酸桿菌進(jìn)行定量檢測并對其臨床應(yīng)用進(jìn)行評價。 方法： 1.根據(jù)Genebank的陰道加德納菌和乳酸桿菌序列，設(shè)計引物，優(yōu)化反應(yīng)體系，建立陰道加德納菌和乳酸桿菌的實時熒光定量PCR方法。 2.用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增所得的陰道加德納菌、16Sr

2、RNA和乳酸桿菌基因片段通過PCR純化試劑盒純化，純化產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品。將標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以拷貝數(shù)的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)，循環(huán)域值(Ct)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 3.對實時熒光定量PCR方法進(jìn)行方法學(xué)評價，包括該方法的靈敏性、線性范圍、特異性和重復(fù)性等。 4.按照Amsel診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷細(xì)菌性陰道?。欢ㄐ訮CR檢測患者陰道分泌物中的陰道加德納菌。 5.實時熒光定量PCR測定患者陰道分泌物中陰

3、道加德納菌-DNA的含量，同時測定標(biāo)本中總的細(xì)菌16SrRNA-DNA的含量進(jìn)行校正，即用陰道加德納菌-DNA含量/16SrRNA-DNA含量的比值表示陰道加德納菌的相對含量。用陰道加德納菌-DNA116SrRNA-DNA比值的受試者工作曲線(ROC)評價細(xì)菌性陰道病的診斷價值。 6.實時熒光定量PCR測定患者陰道分泌物中乳酸桿菌-DNA的含量。用陰道加德納菌-DNA含量/乳酸桿菌-DNA含量的比值表示陰道加德納菌-DNA的相對

4、含量。用陰道加德納菌-DNA/乳酸桿菌-DNA比值的受試者工作曲線(ROC)評價細(xì)菌性陰道病的診斷價值。 7.以細(xì)菌性陰道病患者的陰道分泌物標(biāo)本為研究組，比較陰道加德納菌-DNA/16SrRNA-DNA比值的受試者工作曲線(ROC)和陰道加德納菌-DNA/乳酸桿菌-DNA比值的受試者工作曲線(ROC)診斷細(xì)菌性陰道病的差異。 結(jié)果： 1.成功建立了實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測陰道加德納菌-DNA和乳酸桿菌-DNA

5、的方法，本方法檢測陰道加德納菌-DNA和乳酸桿菌-DNA的靈敏性均為10拷貝數(shù)/反應(yīng)，線性范圍均為10～105拷貝數(shù)/反應(yīng)，Ct值與拷貝數(shù)之間具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.999和0.998；陰道加德納菌-DNA的批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為1.11％～2.70％和1.20％～1.90％，重復(fù)性好。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序分析顯示擴(kuò)增片段分別為陰道加德納菌-DNA和乳酸桿菌-DNA的特異性片段。 2.對220例婦科門診就診患者陰道分泌

6、物標(biāo)本為研究對象。通過鹽水濕片法，根據(jù)Asmel診斷標(biāo)準(zhǔn)44例為細(xì)菌性陰道病、12例為滴蟲性陰道炎、25例為霉菌性陰道炎、139例為“其他陰道炎”和30例健康體檢者。普通PCR測定結(jié)果顯示，44例細(xì)菌性陰道病標(biāo)本有41例陰道加德納菌陽性，12例滴蟲性陰道炎標(biāo)本有8例陰道加德納菌陽性，25例陰道性霉菌炎標(biāo)本有21例陰道加德納菌陽性，139例“其他陰道炎”中任選30例標(biāo)本有25例陰道加德納菌陽性和30例健康體檢者標(biāo)本有12例陰道加德納菌陽性

7、。由此可知，定性PCR的敏感性和特異性分別為93.2％和31.9％。 3.陰道加德納菌-DNA含量/16SrRNA-DNA含量的比值為0.5613400，明顯高于霉菌性陰道炎(P<0.05)、其他陰道炎(P<0.05)及健康體檢者(P<0.05)中的含量，但與滴蟲性陰道炎中的含量無明顯的差異(P>0.05)。陰道加德納菌-DNA含量/16SrRNA-DNA含量比值的受試者工作曲線分析結(jié)果顯示，曲線下面積(AUC-ROC)為0.9

8、09，當(dāng)陰道加德納菌-DNA含量/16SrRNA-DNA含量的截斷值為0.1026035時，診斷細(xì)菌性陰道病的總體敏感度為92.9％、特異度為80.3％、陽性預(yù)測值為74.5％、陰性預(yù)測值為91.4％、陽性似然比為4.69、陰性似然比為0.25。 4.陰道加德納菌-DNA含量/乳酸桿菌-DNA含量的比值為4.041523，明顯高于霉菌性陰道炎(P<0.05)、其他陰道炎(P<0.05)及健康體檢者(P<0.05)中的含量，但與滴

9、蟲性陰道炎中的含量無明顯的差異(P<0.05)。陰道加德納菌-DNA含量/乳酸桿菌-DNA含量比值的受試者工作曲線分析結(jié)果顯示，曲線下面積(AUC-ROC)為0.849，當(dāng)陰道加德納菌-DNA含量/乳酸桿菌-DNA含量的截斷值為0.0268時，診斷細(xì)菌性陰道病的總體敏感度為95.1％，特異度為68.7％，陽性預(yù)測值為65％，陰性預(yù)測值為95.7％，陽性似然比為3.04，陰性似熱比為0.07。 5.用陰道加德納菌-DNA含量/16

10、SrRNA-DNA含量比值的受試者工作曲線和陰道加德納菌-DNA含量厚/酸桿菌-DNA含量比值的受試者工作曲線診斷細(xì)菌性陰道病，兩種參數(shù)檢測結(jié)果一致(0.25

11、異性相對較低。 3.細(xì)菌性陰道病患者的陰道分泌物標(biāo)本中陰道加德納菌-DNA含量/16SrRNA-DNA含量比值和陰道加德納菌-DNA含量厚L酸桿菌-DNA含量比值的含量高，為細(xì)菌性陰道病的診斷提供了理論依據(jù)。 4.陰道加德納菌-DNA含量/16SrRNA-DNA含量比值的受試者工作曲線(ROC)評價細(xì)菌性陰道病診斷價值和陰道加德納菌-DNA含量厚/酸桿菌-DNA含量比值的受試者工作曲線(ROC)診斷細(xì)菌性陰道病好，但是陰