中華鱉嗜水氣單胞菌熒光定量PCR檢測方法的建立和應用.pdf

1、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）是一類廣泛存在于水環(huán)境的常在菌，它不僅能引發(fā)多種水生動物的傳染病，而且也是爬行類、兩棲類、鳥類等動物的重要病原菌，亦可單獨或與其他致病菌共同感染，引發(fā)人類的腹瀉或敗血癥等病癥，影響食品安全。因此嗜水氣單胞菌已成為人獸魚共患病原菌。隨著中華鱉集約化養(yǎng)殖規(guī)模的發(fā)展，由氣單胞菌引起的中華鱉疾病也日益成為中華鱉養(yǎng)殖的主要病害，其中以嗜水氣單胞菌引起的病害較為常見。該菌可引起中華鱉出血

2、性敗血癥、腐皮病、穿孔病、紅脖子病、紅底板病和白底板病等，該菌所致疾病嚴重阻礙了中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。目前，在動物檢驗檢疫中，中華鱉嗜水氣單胞菌的檢測方法主要以細菌的分離培養(yǎng)鑒定為主，直觀，易操作，但耗時長。分子生物學檢測方法如PCR、Real-time PCR，具有敏感性高、特異性強、快速等優(yōu)點。
　　 本研究選取氣溶素(aerolysin)基因aerA為待測靶基因，因其是嗜水氣單胞菌的毒力基因

3、之一，與其致病性基本上呈正相關(guān)，具有種屬特異性，因此可作為致病性嗜水氣單胞菌的標志。
　　 本研究從患病的中華鱉采集樣品，進行細菌的分離培養(yǎng)、涂片染色鏡檢、生化試驗及動物試驗等，并根據(jù)分離株的細菌特征、生化試驗結(jié)果及致病特性等確定分離的3株細菌均為嗜水氣單胞菌。根據(jù)Ah氣溶素基因的保守序列設計一對引物，建立了普通PCR檢測方法。特異性試驗結(jié)果表明，該方法能夠從Ah陽性樣品中特異性的擴增出119bp的片段，而對大腸桿菌、副溶血弧菌

4、、沙門氏菌、創(chuàng)傷弧菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌均無特異性擴增條帶。敏感性試驗顯示，該方法的最低檢測量為2.0×104 CFU/ml的菌液。以所建立的普通PCR方法對送檢的44份樣品進行檢測，陽性檢出率為56.8％。
　　 本研究以質(zhì)粒DNA為模板，建立并優(yōu)化了檢測嗜水氣單胞菌熒光定量PCR方法，可檢測的最低值為2.1×10°個拷貝的細菌DNA，在2.1×103-2.1×108拷貝的細菌DNA范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系(r=0.999

5、)。特異性試驗中嗜水氣單胞菌檢測結(jié)果為陽性，而非嗜水氣單胞菌檢測結(jié)果均為陰性。重復性試驗中批內(nèi)試驗和批間試驗的變異系數(shù)(CV)分別小于2％和3％，說明該方法具有良好的穩(wěn)定性。并且對送檢的44份樣品進行檢測，陽性檢出率為65.9％。該方法與生化鑒定法以及普通PCR法相比特異性強、敏感性高、操作簡便、檢測速率快等特點。
　　 綜上所述，本研究建立了針對嗜水氣單胞菌aerA基因的熒光定量PCR(SYBRGreen)，該方法具有較好的敏