嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)的中華鱉cDNA文庫(kù)構(gòu)建及CCL20分析和表達(dá)研究.pdf

1、首先在同一濕度不同溫度下對(duì)同一規(guī)格的中華鱉卵進(jìn)行了孵化，研究了其胚胎發(fā)育和初生幼體的形態(tài)特征，以及活動(dòng)能力的影響。然后以致病性嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydroph ila）人工感染的中華鱉（Trionyx sinensis）心、肝、脾、腎組織為材料，應(yīng)用SMART（switching mechanism at5'end of RNA transcript）技術(shù)，構(gòu)建了中華鱉全長(zhǎng)的cDNA文庫(kù)。首先用SMARTTM PCR c

2、DNA systhesis kit合成全長(zhǎng)的雙鏈cDNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠分級(jí)分離技術(shù)切除小片段的cDNA，將大于500bp的cDNA連接到pGEM-T載體中，電轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中。在構(gòu)建好的文庫(kù)中，經(jīng)測(cè)定，文庫(kù)約含有4.3×105個(gè)重組子，重組效率92％，插入片段多在0.5-2kb之間。對(duì)庫(kù)中長(zhǎng)度大于1000bp的164個(gè)基因進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果顯示39個(gè)序列在中華鱉中首次發(fā)現(xiàn)，測(cè)序鑒定的基因包括免疫基因11個(gè);信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因6個(gè):

3、催化類基因15個(gè);轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因3個(gè);結(jié)構(gòu)基因7個(gè);未知基因9個(gè)。本論文構(gòu)建成的嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)的中華鱉SMART全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，為免疫基因全長(zhǎng)序列的篩選奠定了基礎(chǔ)。
　　利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的中華鱉SMART全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，篩選并克隆得到編碼巨噬細(xì)胞炎癥蛋白3-α(CCL20)基因的cDNA目標(biāo)序列，其開放閱讀框(Open readingframe，ORF)為303bp，編碼100個(gè)氨基酸組成的多肽鏈，CCL20表達(dá)蛋白的分子量為

4、11429.3，等電點(diǎn)為8.71，根據(jù)同源性分析，中華鱉與黃喉擬水龜（Mauremysmutica）、西部錦龜（Chrysemys picta bellii）、密西西比鱷（Alligator mississippiensis）、原雞（Gallus gallus）、斑胸草雀（Taeniopygia guttata）的同源性較高，其相似性介于71％-84％;和哺乳動(dòng)物的同源性較低。推測(cè)中華鱉CCL20表達(dá)的蛋白為親水性蛋白，其信號(hào)肽位于1-

5、28氨基酸位點(diǎn)上，分裂點(diǎn)位于28-29位氨基酸之間。ExPASY分析顯示蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。同時(shí)CCL20存在跨膜螺旋，而且在其多肽鏈的第34-77氨基酸位置上存在著結(jié)構(gòu)功能域:SMALL-CYTOKINES-CC，為CC亞族小型細(xì)胞因子區(qū)域，又名趨化因子。CCL20保守區(qū)域同時(shí)具有趨化因子超家族（Chemokine superfamily）和趨化因子CC亞族DCCL特殊結(jié)構(gòu)域特征(35aa-95aa)。中華鱉CCL2

6、0蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有較多的α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，其中α螺旋占總體的49％;無(wú)規(guī)則卷曲占總體的37％;延伸鏈占總體的12％。三級(jí)結(jié)構(gòu)可以看出中華鱉CCL20蛋白的最多結(jié)構(gòu)元件為α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈。
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)中華鱉的CCL20基因的組織特異性和表達(dá)特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在正常組中，CCL20基因在脾臟中表達(dá)量最高，在肝臟、腎臟、心臟中都有微量表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量關(guān)系為脾臟（12.9倍）＞肝臟（1.5