嗜水氣單胞菌J-1株脂酶性質(zhì)分析及其克隆表達.pdf

1、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)是淡水魚暴發(fā)性敗血癥的主要病原，該菌能夠引致淡水魚的敗血癥和人的腹瀉等。嗜水氣單胞菌能分泌一系列胞外酶，這些酶對該細菌的生態(tài)適應(yīng)，生存及致病性起著十分關(guān)鍵的作用。脂酶是嗜水氣單胞菌胞外酶的一種，有資料表明某些細菌的脂酶是重要毒力因子。本試驗以嗜水氣單胞菌我國分離魚源株Ah J-1株為模版，應(yīng)用染色體步移技術(shù)擴增脂酶基因全長，為進一步研究脂酶的功能奠定基礎(chǔ)。 1．用1

2、0kDa的截流濾膜超濾、25％-50％的硫酸銨分級沉淀、凝膠過濾層析和陰離子交換層析，獲得純化的嗜水氣單胞菌J-1株胞外脂酶，SDS-PAGE顯示分子量約為80kDa。該酶最適作用pH值為7.4，最適作用溫度為37℃。將純化的脂酶腹腔注射小鼠后，小鼠無一死亡；純化的脂酶與HEp-2細胞共培養(yǎng)，不產(chǎn)生細胞病變，表明該酶對動物和細胞無毒性。 2．根據(jù)已發(fā)表的引物序列合成一對引物，以嗜水氣單胞菌J-1株基因組為模板擴增脂酶基因，結(jié)果得

3、到一個保守的383bp基因片段。進一步應(yīng)用染色體步移技術(shù)擴增其兩側(cè)未知序列，分別以Dra Ⅰ、EcoR Ⅴ、Pvu Ⅱ、Sca Ⅰ、Stu Ⅰ、Sma Ⅰ 6個內(nèi)切酶酶切的基因組構(gòu)建6個不同的染色體步移文庫，再以染色體步移文庫做為模板，設(shè)計引物向已獲得的保守片段兩側(cè)進行PCR擴增，將擴增到的兩側(cè)序列與保守片段拼接后得到一個3476bp的片段，通過DNAStar軟件分析，找到一個2415bp的開放閱讀框，經(jīng)BLAST軟件分析，其與嗜水氣單

4、胞菌ATCC 7966脂肪酶、嗜水氣單胞菌AH-3磷脂酶A1、嗜水氣單胞菌H3脂肪酶、嗜水氣單胞菌Mcc-2脂肪酶、嗜水氣單胞菌JMP636磷脂酶C的序列同源性分別為97％、97％、88％、83％和82％。將DNA序列翻譯成氨基酸序列后，發(fā)現(xiàn)其包含一個多肽序列(VHFLGHSLGA)，這個序列在脂酶中是高度保守的。對本實驗室保存的35株氣單胞菌分離株進行了脂酶的表型檢測(三丁酸甘油酯作為底物)和PCR檢測，結(jié)果分別為83％和100％，特

5、別是嗜水氣單胞菌無毒株W1和Ah4332也能檢測到脂酶活性或基因，表明脂酶在該菌的致病機制中不是決定性因子。 3．以染色體步移獲得的序列為模版，用Primer5.0軟件設(shè)計一對含酶切位點的特異引物擴增脂酶基因全長，經(jīng)PCR擴增得到目的產(chǎn)物，EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ雙酶切后以正確閱讀框架定向克隆于經(jīng)同樣雙酶切的pET-32a(+)中，轉(zhuǎn)化表達宿主菌E. coli BL21。該菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可表達分子量約80 kDa的融合蛋白