淇河鯽GPx1和GPx4基因的克隆及其對嗜水氣單胞菌的響應(yīng).pdf

1、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPx)是細(xì)胞中抗氧化系統(tǒng)的重要組成分，主要功能是排除細(xì)胞內(nèi)過多的氧自由基，從而保護(hù)生物體遺傳物質(zhì)的完整性、細(xì)胞膜的穩(wěn)定性等。水生動(dòng)物因特異性免疫不完善，故其自身天然免疫尤為重要。最近，很多實(shí)驗(yàn)已證明GPx參與水生動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化過程。淇河鯽（Qihe crucian carp Carassiusauratus）作為河南省珍稀水產(chǎn)品，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，所以探究

2、淇河鯽GPx基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其對病原菌的免疫響應(yīng)有助于理解GPx的生物學(xué)功能。本論文以淇河鯽為研究對象，提取淇河鯽肝臟總RNA，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出GPx1和GPx4cDNA全長序列;利用qPCR技術(shù)檢測了GPx1在正常淇河鯽9種器官組織中的表達(dá)水平及嗜水氣單胞菌處理后在肝、鰓、腎、脾和頭腎中的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可幫助我們理解淇河鯽的抗氧化保護(hù)響應(yīng)，同時(shí)為淇河鯽疾病防控提供理論基礎(chǔ)。
　　根據(jù)已知序列，設(shè)計(jì)和合成相應(yīng)PCR引物

3、，采用RT-PCR方法同時(shí)克隆出淇河鯽GPx1和GPx4中間保守序列，采用RACE方法獲得3'-UTR和5'-UTR，通過拼接后分別得到GPx1(889 bp)和GPx4(875 bp)cDNA完整序列。淇河鯽GPx1的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)為576 bp，翻譯191個(gè)氨基酸。預(yù)測淇河鯽GPx1的相對分子質(zhì)量是21.61KD，理論等電點(diǎn)為6.84。在酶催化中心，Se結(jié)合位點(diǎn)是第158～160位密碼子編

4、碼的半胱氨酸。兩個(gè)家族標(biāo)簽序列:65LGAPCNQF72、153WNFEKF158。淇河鯽GPx1無跨膜區(qū)與信號(hào)肽，是一種胞內(nèi)酶。淇河鯽GPx4的ORF共513bp，翻譯170個(gè)氨基酸。預(yù)測其分子質(zhì)量為19.31KD，理論等電點(diǎn)為7.64?；钚灾行牡腟e結(jié)合位點(diǎn)是第208～210位密碼子編碼的半胱氨酸。GPx4家族標(biāo)簽序列:71LGFPCNQF78、136WNFTKF141。同時(shí)將兩個(gè)基因的氨基酸全長序列放在NCBI中進(jìn)行BLAST比對

5、，發(fā)現(xiàn)它們在不同物種中均有較高的保守性。
　　運(yùn)用RT-qPCR技術(shù)檢測淇河鯽9種器官組織（肝、心、肌肉、脾、腸、頭腎、卵巢、腎和鰓）中GPx1 mRNA表達(dá)特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GPx1在各器官組織中均有表達(dá)，且其表達(dá)存在組織特異性。其中，肝中表達(dá)量最高，在鰓、頭腎、腎、心、腸、脾、卵巢和肌肉中的表達(dá)量依次降低。同時(shí)采用RT-qPCR技術(shù)檢測了淇河鯽胚胎發(fā)育不同時(shí)期的GPx1 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示，從受精到胚胎發(fā)育再到孵化破膜

6、，GPx1 mRNA表達(dá)量逐漸升高。
　　利用嗜水氣單胞菌對淇河鯽進(jìn)行人工感染，采用RT-qPCR技術(shù)檢測肝、鰓、腎、脾、頭腎中GPx1 mRNA在0h、3h、6h、12h、24 h及48 h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。結(jié)果表明，經(jīng)嗜水氣單胞菌侵染后，除鰓外GPx1在各器官組織中的表達(dá)均呈現(xiàn)極顯著變化（p＜0.01**），其變化趨勢為:表達(dá)量先上調(diào)，然后下降，在頭腎中還出現(xiàn)了再次上升的現(xiàn)象，而且均是在6h達(dá)到最大表達(dá)量，這顯示淇河鯽GP

7、x1可能在嗜水氣單胞菌侵染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著十分重要的作用。但是在鰓中GPx1 mRNA表達(dá)量在處理組與對照組之間無顯著變化，其原因可能是由于不同器官組織間存在差異所致。
　　本研究結(jié)論如下:
　　(1)擴(kuò)增得到淇河鯽GPx1和GPx4 cDNA完整序列。淇河鯽GPx1 cDNA全長序列889 bp，翻譯191個(gè)氨基酸;淇河鯽GPx4 cDNA完整序列有875 bp，翻譯170個(gè)氨基酸。
　　(2)經(jīng)嗜水氣單胞菌侵染后