嗜水氣單胞菌的分離鑒定及其Hfq功能的研究.pdf

1、嗜水氣單胞菌是引起水產(chǎn)養(yǎng)殖細菌性疾病的一種主要病原菌，對全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的危害和經(jīng)濟損失。同時亦可感染人類，對人體健康造成嚴重威脅，是一種典型的人-魚共患致病菌。深入研究嗜水氣單胞菌的毒力調(diào)控機制對于其引發(fā)的病害防治具有重要意義。Hfq是一種廣泛存在于細菌體內(nèi)的sRNA分子伴侶蛋白，可促進不同sRNA分子與其靶標mRNA分子間的相互作用，作為轉(zhuǎn)錄后全局調(diào)控因子參與細菌的多種生理進程，并對多種病原菌的毒力具有重要的調(diào)控作用。本論文

2、從山東煙臺養(yǎng)殖魚場發(fā)病石斑魚體內(nèi)分離得到一株優(yōu)勢毒力菌株，通過生理生化及分子生物學手段鑒定為嗜水氣單胞菌，以該菌株為研究對象，克隆得到其hfq基因序列，利用無標記基因缺失手段成功構(gòu)建獲得Δhfq突變株，并進一步研究了Hfq對嗜水氣單胞菌不同生理功能及毒力的調(diào)控作用，為豐富人們對嗜水氣單胞菌毒力調(diào)控機制及其科學防治提供理論依據(jù)。本論文的研究結(jié)果如下：
　　(1)從養(yǎng)殖魚場發(fā)病的石斑魚胰腺組織中分離到一株優(yōu)勢菌株，通過對其生長特性、生

3、理生化特性等研究，發(fā)現(xiàn)分離菌株為革蘭氏陰性短桿菌，可形成β溶血圈;能夠發(fā)酵利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、還原硝酸鹽、分解利用麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、蔗糖等，不能分解枸櫞酸鹽、木糖、肌醇等;對頭孢曲松、磷霉素、等四種極度敏感，對青霉素、氨芐西林等六種不敏感。進一步通過16S rRNA序列克隆比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析發(fā)現(xiàn)，該菌和其他已知的嗜水氣單胞菌16S rRNA基因序列同源性高達99％以上，并且在進化樹上處于同一個分支上，結(jié)合生理生化特性確定為嗜

4、水氣單胞菌，人工回歸感染試驗表明分離到的嗜水氣單胞菌具有致病性。
　　(2)對嗜水氣單胞菌hfq基因進行了克隆，得到264 bp大小的特異性片段，編碼88個氨基酸。Hfq蛋白二級結(jié)構(gòu)包含1個由12個氨基酸組成α-螺旋區(qū)(H)和32個氨基酸組成的5個β-折疊區(qū)(E)，其他區(qū)域均為無規(guī)則卷曲區(qū)（-）。Hfq蛋白三維空間結(jié)構(gòu)是一個中空環(huán)狀的六聚體。成功構(gòu)建了Hfq重組表達質(zhì)粒pET28a(+)-hfq，通過誘導(dǎo)表達成功檢測到一條大小約為

5、12 kDa的特異性蛋白條帶，且其表達量隨誘導(dǎo)時間的延長而增加。
　　(3)利用自殺質(zhì)粒pDM4，通過同源重組的方法成功構(gòu)建了嗜水氣單胞菌的無標記hfq基因框內(nèi)缺失突變株Δhfq。通過對野生型和Δhfq突變株不同表型測定發(fā)現(xiàn)，在對數(shù)生長期內(nèi)，Δhfq突變株的生長相對于野生型有所下降;在進入穩(wěn)定期后，Δhfq突變株的生長達到與野生型相當?shù)乃?，并在后期略微有所提高。Hfq對游動性具有正調(diào)控作用，對泳動性和溶血活性調(diào)控不明顯;當Hfq