IHHNV和LCDV實時定量PCR檢測方法的建立與應用.pdf

1、傳染性皮下及造血器官壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV)可感染世界各地養(yǎng)殖對蝦，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。本研究首次采用實時定量PCR法對廣西地區(qū)的84份凡納濱對蝦樣品進行檢測，同時以常規(guī)PCR檢測作對照。實時定量PCR檢測陽性率為79.8％，常規(guī)PCR檢測陽性率為40.5％，且常規(guī)PCR檢測呈陽性的樣品均包含在實時定量PCR檢測呈陽性之

2、中，也表明廣西地區(qū)養(yǎng)殖的凡納濱對蝦IHHNV的感染率較高。將兩者檢測均呈陽性的30份樣品擴增產(chǎn)物進行序列分析測序，測序結果通過DNA STAR軟件包進行分析，并通過NCBI Blast與GenBank中的序列進行比對，結果證明測定的是IHHNV序列。30份樣品的IHHNV序列很保守，可以分為4種類型，僅有兩個堿基的位置發(fā)生變異。實時定量PCR檢測IHHNV，快速、靈敏、準確，特異性好，可以作為檢測對蝦感染病毒的有效方法。 淋巴囊

3、腫病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)廣泛分布于世界各地的淡水、半咸水和海水中，可感染9目34科計140種以上魚類。淋巴囊腫病是對魚類危害較為嚴重的病毒病之一，其感染率可高達80％，死亡率可達30％。本研究建立Taqman、SYBR Creen I實時定量PCR方法檢測淋巴囊腫病毒。選取LCDV的主要衣殼蛋白(major capsid protein，MCP)基因保守序列，利用Primer Expres

4、s 2.0軟件設計引物和探針。 Taqman實時定量PCR中，以梯度稀釋的含有LCDV目的擴增片段的質(zhì)粒作為標準品，進行靈敏度檢測，質(zhì)粒濃度為3×107～30個拷貝內(nèi)都有擴增曲線，檢測限為30個病毒拷貝。根據(jù)病毒拷貝數(shù)(X)與Ct值的關系，制備了標準曲線?？截悢?shù)(X)與Ct的關系為：Ct=-3.631gX+41.86，相關系數(shù)R2=0.9915。特異性實驗中，Taqman實時定量PCR對流行性造血器官壞死病毒(Epizootic

5、 haematopoietic necrosis virus，EHNV)、蛙虹彩病毒(Bohle iridovirus，BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)、真鯛虹彩病毒(Sea bream iridovirus，RSIV)都沒有擴增反應。利用建立的方法對我國養(yǎng)殖場的魚類進行檢測，共檢測到12批LCDV陽性樣品，并利用標準曲線對病毒進行了定量分析。將陽性樣品的常規(guī)PCR產(chǎn)物進

6、行純化測序，證實是LCDV序列。Taqman實時定量PCR檢測LCDV，靈敏度高，特異性好，可以進行定量分析，可成為一種早期檢測LCDV的新方法。 SYBR Green I實時定量PCR中，優(yōu)化了定量PCR的反應條件，反應體系的最佳引物濃度為0.5μM。該方法能特異檢測出淋巴囊腫病毒，不能擴增流行性造血器官壞死病毒(Epizootic haematopoietic necrosis virus，EHNV)、虎紋蛙病毒(Tiger

7、 frog virus，TFV)、蛙虹彩病毒(Bohle iridovirus，BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)、鱖魚傳染性脾腎壞死病毒(Infectiousspleen and kidney necrosis virus，ISKNV)及真鯛虹彩病毒(Sea bream iridovirus,RSIV)。利用該方法對12份發(fā)病牙鲆魚樣品進行檢測，均呈陽性。重復性測試中，S